Анализ лизата амебоцитов Gel-Clot Limulus: метод обнаружения бактериального эндотоксина в составах наночастиц

Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий содержит эндотоксины, называемые липополисахаридами, или ЛПС. ЛПС имеет гидрофильную олигосахаридную часть и гидрофобную липидную область А.

Попадая внутрь хозяина, ЛПС-связывающие белки распознают эндотоксины. Эти белки затем связываются с рецепторами на циркуляторных иммунных клетках. Это связывание активирует иммунные клетки, которые выделяют воспалительные факторы. Чрезмерное производство этих факторов усиливает иммунный ответ, вызывая гибель клеток.

Для обнаружения эндотоксинов с помощью лизата амебоцитов Limulus или анализа LAL используется состав, содержащий эндотоксины, связывающиеся с липофильной поверхностью наночастиц через их гидрофобные липидные части А.

Добавьте в пробирку реагент LAL. Этот реагент представляет собой водный лизат, содержащий неактивные ферменты и белки, полученные из амебоцитов - клеток крови мечехвоста.

Инкубируйте пробирку, чтобы облегчить связывание эндотоксинов с проферментом С, полученным из лизата, неактивным фактором свертывания крови, активируя его автокаталитически.

Активированный фактор С расщепляет другой профермент, фактор В, образуя протеазу, которая расщепляет просвертывающий фермент и превращает его в активную форму – лимулюсный фермент свертывания. Этот фермент расщепляет коагулоген - неактивный белок свертывания крови - на коагулин.

Мономера коагулина связываются через свои гидрофобные хвосты с гидрофобными головками других мономеров коагулина. Эта самополимеризация приводит к образованию гомополимера, который выглядит в виде студенистого сгустка у основания трубки. Осторожно переверните трубку.

Твердый сгусток, который остается на дне трубки, подтверждает наличие эндотоксинов.

Для выполнения гелеобразного сгустка ЛАЛ необходимо подготовить контрольный стандартный эндотоксин до конечной концентрации 4 лямбда и соединить 100 микролитров стандартного эндотоксина со 100 микролитрами воды или исследуемого образца для достижения окончательной концентрации контрольного стандартного эндотоксина 2 лямбда.

Добавьте 100 микролитров лизата в каждое разведение лямбда. Кратковременно перебейте трубки и поместите штатив с трубками в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 1 час.

В конце инкубации плавным движением переверните трубки, а результаты вручную запишите с помощью плюса для твердого сгустка, и минуса для отсутствия сгустка или рыхлого сгустка.