$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ферменты, расщепляющие углеводы, расщепляют сложные полисахариды на более мелкие олигосахариды.
Для скрининга активности фермента деградации начинают с приема множественных хромогенных полимерных гидрогелей CPH, которые получают путем окрашивания полисахаридов разноцветными хлортриазиновыми красителями. Затем каждый полисахарид химически сшивается с образованием гидрогеля - синтетического субстрата для ферментативного разложения.
Теперь распределите различные подложки CPH в отдельные лунки пористой реакционной пластины. Добавьте раствор для активации и инкубируйте его, чтобы обеспечить оптимальную активацию субстратов.
Положите пробирную пластину на пустую тарелку с продуктом. Центрифугируйте пластины вместе с низкой скоростью, чтобы обеспечить эффективное удаление активационного раствора через поры реакционной пластины.
Затем дополните все лунки реакционной пластины тем же типом фермента, разрушающего углеводы, в соответствующем буфере, который поддерживает оптимальный pH для ферментативной активности. Запечатайте планшет и инкубируйте его с легким перемешиванием, чтобы обеспечить равномерное распределение ферментов в полимерной сети, что позволит им получить доступ к субстрату.
Во время инкубации фермент, обладающий соответствующей активностью по отношению к субстрату, разрушает полисахариды в CPH с образованием более мелких олигосахаридов, связанных с красителем. Эти продукты являются растворимыми, что делает раствор цветным. Вращайте пластины, чтобы собрать цветной раствор в тарелку с продуктом.
Спектрофотометрически определяют абсорбцию продукта для измерения активности фермента.
Для начала активируйте 96-луночный набор для анализа фильтров, добавив 200 микролитров раствора активации в каждую лунку. Выдерживать при комнатной температуре без перемешивания в течение 10 минут.
Используйте центрифугу и любой стандартный 96-луночный планшет для сбора, чтобы раскрутить существующий раствор для активации. Добавьте 100 микролитров стерильной воды в хромогенный полимерный гидрогель или субстраты CPH и примените вакуум или отжим для удаления стабилизатора. Повторите стирку еще два раза.
Чтобы приготовить ферментную реакцию, добавьте 150 микролитров 100-миллимолярного буфера ацетата натрия pH 4,5 и 5 микролитров раствора эндоцеллюлазы с тремя различными концентрациями, в каждую лунку планшета для анализа.
Поместите пластину с продуктом под пластину пробирного набора, чтобы собрать любую потенциальную утечку из реакционной пластины во время встряхивания. Затем инкубируйте планшет для анализа при комнатной температуре в горизонтальном шейкере со скоростью 100 об/мин в течение 30 минут.
Для получения достоверных данных необходимо перемешивать реакционную смесь во время инкубации.
Поместите планшет с набором для анализа вместе с планшетом с продуктом под него в центрифугу и вращайте при давлении 2 700 x g в течение 10 минут, чтобы перенести продукт реакции в лунки планшета с продуктом.
После отжима визуально осмотрите пластину с продуктом, чтобы убедиться, что объем жидкости в каждой лунке примерно одинаков. С помощью считывателя планшетов считайте поглощение сборной пластины на 630 нанометрах для различных зеленых подложек CPH.