Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:27 мин. • July 8th, 2025
Биомасса — это органическое вещество растительного происхождения, состоящее в основном из сложных полисахаридов. Ферменты, разрушающие углеводы, действуют на эти полисахариды, производя более мелкие олигосахариды.
Чтобы оценить деструктивную активность фермента, начинают с забора различной нерастворимой хромогенной биомассы - субстратов ICB, присутствующих в лунках пористой реакционной пластины. Эти субстраты получают путем окрашивания материалов растительного происхождения красителем определенного цвета хлортриазином. Полученная биомасса содержит помеченные красителями сложные полисахариды, служащие субстратом для активности ферментов.
Теперь добавьте буферный раствор, содержащий фермент, гидролизующий углеводы. Буфер поддерживает pH для оптимальной активности ферментов. Поместите реакционную пластину в шейкер и инкубируйте. Постоянное перемешивание позволяет молекулам фермента достигать целевого полисахарида в субстрате ICB.
Во время инкубации гидролизующий фермент расщепляет ковалентные гликозидные связи внутри длинноцепочечных полисахаридов. В результате реакции образуются растворимые олигосахариды, связанные с молекулами красителя, которые остаются в растворе.
По завершении разложения поместите реакционную пластину поверх пластины с продуктом и центрифугируйте сборку. Во время центрифугирования окрашенный раствор, содержащий продукты реакции, проходит через фильтр в нижней части планшета и собирается в продуктовой пластине. С помощью планшетного ридера запишите поглощение надосадочной жидкости.
Более высокое значение абсорбции указывает на образование большого количества олигосахаридов, связанных с красителем, что указывает на эффективность фермента в деградации субстрата ICB.
Чтобы провести хромогенный анализ с красной нерастворимой хромогенной биомассой, или ICB-пшеничной соломой, начните с добавления 200 микролитров активационного раствора в каждую лунку пробирной пластины. Затем инкубируйте тарелку при комнатной температуре, без перемешивания в течение 10 минут.
Снимите стабилизатор, используя 100 микролитров стерильной воды, чтобы трижды промыть лунки. Затем добавьте 150 микролитров 100-миллимолярного буфера ацетата натрия, pH 4,5, и 5 микролитров 10 единиц на миллилитр различного раствора эндо-ксиланазы.
Поместите пластину с продуктом под пластину подложки, чтобы собрать любую потенциальную утечку из подложной пластины во время встряхивания, и инкубируйте реакцию при комнатной температуре и 100 об/мин в течение 2 часов.
После инкубации поместите планшет с набором для анализа вместе с планшетом с продуктом под ним в центрифугу и вращайте при давлении 2 700 x g в течение 10 минут, чтобы перенести продукт реакции в лунки планшета с продуктом.
Проверьте, чтобы объем жидкости в каждой лунке был примерно одинаковым. Затем, используя считыватель планшетов, считайте поглощение сборной пластины на 517 нанометрах для красной ICB-пшеничной соломы.