Дифференциальное ядерное окрашивание: анализ для определения цитотоксичности митокана с помощью йодида пропидиума и двойного окрашивания по методу Хёхста

Митоканы — это класс препаратов, которые избирательно влияют на функционирование митохондрий в раковых клетках и индуцируют апоптоз.

Чтобы определить цитотоксичность митокана, засейте клеточную суспензию, содержащую полуадгезивные раковые клетки, в многолуночный планшет. Обработайте тарелку нужным раствором митокана и инкубируйте.

Митокан проникает в раковую клетку, нарушая ее митохондриальную активность, что в конечном итоге приводит к гибели чувствительных к митокану раковых клеток. Обработайте клетки окрашивающим раствором, содержащим смесь красителя Хёхста и йодида пропидиума.

Hoechst, мембранопроницаемый флуоресцентный краситель, проникает во все клетки и связывается с богатой AT-областью их ДНК, придавая синюю флуоресценцию ядрам как живых, так и мертвых клеток.

Напротив, йодид пропидия, непроницаемый для мембран флуоресцентный краситель, проникает исключительно в мертвые клетки через поврежденные участки их мембран. Краситель интеркалируется между основаниями ДНК, придавая дополнительную красную флуоресценцию мертвым клеткам. Присутствие обоих красителей в ядрах этих клеток заставляет мертвые клетки казаться фиолетовыми.

Центрифугируйте планшет на низкой скорости, чтобы оседать ячейки для повышения точности во время визуализации. Получите изображение под флуоресцентным микроскопом и наблюдайте за двумя различными клеточными популяциями. Подсчитайте количество ячеек обоих типов.

Процентное соотношение фиолетовых клеток, представляющих мертвую популяцию, по сравнению с общей популяцией указывает на цитотоксический потенциал тестируемого митокана.

Начните с приготовления растворов интересующих соединений в нужной концентрации. Всегда обязательно перемешивайте составы, тщательно перемешивая вортексом.

Чтобы измерить цитотоксичность одного соединения, готовят соединения в 2-кратной конечной концентрации. При измерении цитотоксичности комбинаций соединений приготовьте их в 4-кратной конечной концентрации.

Приготовьте средства контроля, содержащие только растворители, смешав такое же количество растворителя с соответствующей средой. Соберите клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку, и апикотируйте 10 микролитров клеточной суспензии для окрашивания трипановым синим. Добавьте в аликвоту 10 микролитров 0,4% трипанового синего и с помощью гемоцитометра или счетчика клеток подсчитайте жизнеспособные и нежизнеспособные клетки.

Пеллетные клетки в 15-миллилитровую пробирку при 200 х г в течение 5 минут, затем отсасывают или сцеживают надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в подходящей для анализа среде с плотностью клеток 3x10⁵ клеток на миллилитр. С помощью многоканальной пипетки внесите 50 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета.

Для анализа одного соединения добавьте в каждую лунку по 50 микролитров 2Х раствора соединения. Для лунок для контроля растворителей добавьте 50 микролитров тестовой среды, содержащей растворитель в концентрации 2X. Для комбинированных анализов добавьте по 25 микролитров каждого из соединений 4X в каждую лунку. Для одиночных контрольных лунок добавьте по 25 микролитров в каждый из 4X раствора компаунда и тестовой среды. Следите за тем, чтобы конечная концентрация ДМСО не превышала 0,5%.

Чтобы обеспечить воспроизводимость, добавляйте лекарства так, чтобы кончик пипетки касался стенок лунок, стараясь добавлять лекарства в разные места. Этот шаг следует выполнить очень быстро, желательно занимать не дольше 30 минут на одну тарелку.

Аккуратно постукивайте по тарелке, чтобы перемешать содержимое лунок, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Когда клетки будут окрашены Hoechst 33342 и йодидом пропидия, приготовьте свежий раствор для окрашивания 10X и добавьте по 10 микролитров в каждую лунку. Аккуратно постучите по тарелке и выдерживайте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Центрифугируйте планшет при давлении 200 x g в течение 4 минут, чтобы довести все клетки до нижней части планшета. Затем осторожно протрите нижнюю часть пластины влажной лабораторной салфеткой, чтобы удалить мусор, который может помешать визуализации. Сфотографируйте планшет в течение 15 минут после центрифугирования.