Анализ связывания аннексина V: флуоресцентный метод идентификации апоптотических эритроцитов с помощью мечения фосфатидилсерином

При определенных патологических состояниях эритроциты или эритроциты претерпевают сокращение клеток, сопровождающееся транслокацией мембранного фосфолипида - фосфатидилсерина - из внутренней в наружную мембранную листку, приводящую к запрограммированной гибели клеток, эриптозу, запускающему макрофаг-опосредованный фагоцитоз клеток.

Чтобы измерить ионофор-индуцированный эриптоз в изолированной популяции эритроцитов человека с помощью анализа связывания аннексина V, начните с эритроцитов, взвешенных в буфере, не содержащем глюкозы.

Истощение глюкозы вызывает клеточный стресс, активируя цитозольную протеинкиназу С, которая впоследствии активирует кальциевые каналы и вызывает приток ионов кальция. Далее активируются калиевые каналы, что приводит к оттоку калия и сокращению клеток.

Далее добавьте ионофор кальция, который образует устойчивый комплекс с внеклеточными ионами кальция. Комплекс способствует цитозольному поступлению ионов кальция через клеточную мембрану, еще больше увеличивая внутриклеточную концентрацию кальция. Это, в свою очередь, активирует скрамблазу - двунаправленный транспортер фосфолипидов, который способствует транслокации фосфатидилсерина от внутренней к внешней части клеточной мембраны, уменьшая асимметрию мембраны и вызывая эриптоз.

Центрифугируйте эритроциты, обработанные ионофорами. Ресуспендируйте клетки в буфере, содержащем кальций. Добавьте флуоресцентный раствор конъюгированного красителя Аннексин V.

Кальций-зависимый фосфолипидсвязывающий белок, аннексин V, обладающий высоким аффинностью к фосфатидилсерину, связывается с экспонированными остатками фосфатидилсерина на листке наружной клеточной мембраны.

С помощью сортировки клеток, активируемых флуоресцентными лампами, разделить популяцию эритроцитов на основе интенсивности флуоресценции аннексина V. Эриптотические эритроциты демонстрируют более высокую интенсивность флуоресценции аннексина V, чем здоровые эритроциты.

Разведите 2 миллилитра связывающего буфера 5X Annexin V в 8 миллилитрах PBS для получения 1X связывающего буфера. Ресуспендируйте обработанные иономицином и необработанные клеточные гранулы в 1 миллилитре связывающего буфера 1X.

Возьмите 235 микролитров клеточных суспензий в связывающем буфере и добавьте 15 микролитров конъюгата Annexin V-Alexa Fluor 488 в микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 20 минут в темном месте.

Центрифугируйте при давлении 700 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость. Дважды промойте клетки связывающим буфером 1X, суспензив клеточную гранулу в 1,5 миллилитрах связующего буфера и центрифугируя при 700 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 250 микролитрах связывающего буфера 1X для измерений проточной цитометрии. Теперь перенесите 200 микролитров эритроцитов, окрашенных Аннексином V, в 1-миллилитровые полистирольные пробирки с круглым дном, совместимые с проточной цитометрией.

Войдите в программное обеспечение проточной цитометрии и нажмите кнопку «Новый эксперимент». Нажмите на кнопку «Новая трубка», выберите «Глобальный лист» и выберите «Применить анализ» для измерения интенсивности флуоресценции с длиной волны возбуждения 488 нанометров и длиной волны излучения 530 нанометров.

Установите количество клеток равным 20 000, которые будут собраны для анализа сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. Выберите нужную трубку и нажмите на кнопку «Загрузить». Нажмите на кнопку "Запись" для измерения прямого и бокового рассеяния. Повторите для всех образцов.

Щелкните правой кнопкой мыши кнопку «Образец» и нажмите «Применить пакетный анализ», чтобы создать файл результатов. Щелкните правой кнопкой мыши кнопку «Образец» и нажмите «Создать файлы FSC».