Анализ истощения глюкозы in vitro: флуоресцентный метод количественной оценки клеточного поглощения глюкозы с помощью измерения внеклеточного истощения глюкозы

Глюкоза, основной клеточный источник энергии, поступает в клетки через белки-транспортеры глюкозы на клеточных мембранах. Глюкоза расщепляется в цитоплазме клетки до пирувата через гликолитический путь, генерируя энергию с помощью аденозинтрифосфата, или АТФ, для клеточного метаболизма.

Чтобы измерить внутриклеточное поглощение глюкозы, начните с адгезивной культуры фибробластов в многолуночном планшете. Замените среду средой без глюкозы и инкубируйте. Клетки метаболизируют доступную глюкозу для производства энергии, достигая состояния глюкозного голодания.

Замените среды в одном наборе лунок на безглюкозные среды, содержащие инсулин, стимулятор поглощения глюкозы, и флуоресцентную дезоксиглюкозу, аналог глюкозы. Обработайте другой набор лунок безглюкозными средами, содержащими флуоресцентную дезоксиглюкозу.

Во время инкубации инсулин стимулирует транслокацию дополнительных транспортеров глюкозы к плазматической мембране, способствуя повышенному поглощению флуоресцентной дезоксиглюкозы в отсутствие глюкозы.

Дезоксиглюкоза фосфорилируется и не метаболизируется клетками дальше. Одновременно снижается внеклеточная концентрация флуоресцентной дезоксиглюкозы.

После инкубации соберите среды, содержащие неутилизированную флуоресцентную дезоксиглюкозу. Обработайте клетки с помощью буфера для лизиса. Детергент в буфере образует мицеллы и солюбилизирует клеточные мембраны, вызывая высвобождение внутриклеточного содержимого.

С помощью считывателя микропланшетов измерьте флуоресценцию клеточного гомогената, содержащего внутриклеточную флуоресцентную дезоксиглюкозу, и среды, содержащей неиспользованную внеклеточную флуоресцентную дезоксиглюкозу.

Инсулин-стимулированные фибробласты демонстрируют повышенное внутриклеточное поглощение флуоресцентной дезоксиглюкозы и соответствующее снижение внеклеточной флуоресцентной дезоксиглюкозы по сравнению с нестимулированными клетками.

Используйте 8 репликаций для каждого условия моделирования. Поэтому подготовьте 1 миллилитр для каждого условия моделирования.

Используйте 7 условий моделирования без инсулина: FD-глюкоза 2,5 мкг на миллилитр, 1 мкг на миллилитр, 0,5 мкг на миллилитр, 0,2 мкг на миллилитр, 0,1 мкг на миллилитр, 0,05 мкг на миллилитр и 0 мг на миллилитр в одном 96-луночном планшете.

Используйте 7 условий стимуляции инсулином: FD-глюкоза 2,5 мкг на миллилитр, 1 мкг на миллилитр, 0,5 мкг на миллилитр, 0,2 мкг на миллилитр, 0,1 мкг на миллилитр, 0,05 мкг на миллилитр и 0 мкг на миллилитр в другом 96-луночном планшете.

Для приготовления условий стимуляции разведите 1 микролитр 5 мг на миллилитр рабочего раствора FD-глюкозы и 999 микролитров безглюкозного DMEM до получения 1 миллилитра раствора рабочего состава.

Используя этот раствор рабочего состава, готовят разведения FD-глюкозы в дозах 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 и 1:100 000 для получения 2,5 мкг на миллилитр, 1 мкг на миллилитр, 0,5 мкг на миллилитр, 0,2 мкг на миллилитр, 0,1 мкг на миллилитр, 0,05 мкг на миллилитр в 2-миллилитровых пробирках непосредственно перед экспериментами в шкафу биобезопасности без подсветки. Добавьте по 1 микролитру инсулина в каждое из этих состояний.

После 40 минут инкубации сцедите не содержащую глюкозы DMEM из каждой лунки в 96-луночные планшеты, а оставшуюся жидкость впитайте стерильными бумажными полотенцами. Добавьте по 100 микролитров из различных условий обработки, описанных ранее, в лунки вдоль одной колонки и по 100 микролитров из тех же условий обработки в лунки вдоль ряда в обеих 96-луночных пластинах. Пометьте пластины, на которых использовались условия с инсулином и без него.

Добавляйте в контрольные лунки только ДМЭМ, не содержащую глюкозы. Инкубируйте планшет в течение 40 минут в инкубаторе для клеточных культур в темноте.

После стимуляции клеток в течение 40 минут перенесите стимулирующую среду с обоих планшетов на новые 96-луночные планшеты, сохраняя ту же экспериментальную схему. Промойте клетки с помощью PBS. Удалите PBS и сцедите оставшийся раствор на стерильные бумажные полотенца.

Добавьте ингибитор протеазы в буфер для анализа радиоиммунной преципитации для защиты белков. Поместите планшеты, содержащие анализ на радиоиммунопреципитацию, в шейкер на 30 минут.

С помощью микропланшетного ридера измерить флуоресценцию на длинах волн возбуждения и излучения 485 и 535 нм соответственно, сначала в среде, содержащей внеклеточную FD-глюкозу, а затем на планшете с радиоиммунопреципитацией проанализированных клеток по окончании 30-минутной инкубации.