Измерение истощения внеклеточных флуоресцентных аналогов глюкозы: метод суррогатных измерений для оценки поглощения глюкозы в органах мышей ex vivo

В тканях внеклеточная глюкоза поступает в клетки посредством облегченной диффузии через специфические переносчики глюкозы.

Глюкоза расщепляется до пирувата в цитоплазме клетки посредством гликолиза, метаболического пути, генерирующего энергию в форме аденозинтрифосфата, или АТФ, для клеточных метаболических процессов.

Чтобы измерить поглощение глюкозы ex vivo, начните со свежесобранной ткани печени мыши небольшого размера. Добавьте подходящий буфер для поддержания физиологического состояния.

Далее перенесите ткань в многолуночный планшет, содержащий среды, не содержащие глюкозы. После этого следует инкубация в средах, не содержащих глюкозу, с добавлением дезоксиглюкозы, аналога глюкозы с флуоресцентной меткой. Небольшой размер ткани допускает поступление дезоксиглюкозы.

Дезоксиглюкоза поступает в клетки через переносчики глюкозы, в отсутствие глюкозы. Внутри клеток дезоксиглюкоза фосфорилируется, но не метаболизируется дальше, что приводит к ее накоплению.

Соберите среды, содержащие неиспользованную флуоресцентно меченую дезоксиглюкозу, в желаемые моменты времени. С помощью считывателя микропланшетов измерьте флуоресценцию внеклеточной дезоксиглюкозы, которая может быть коррелирована с поглощением дезоксиглюкозы внутриклеточными тканями.

Инкубируйте собранные ткани или органы в 6-луночном планшете, содержащем PBS, в течение одной минуты. Обрабатывайте каждую ткань или орган в отдельной лунке. Через одну минуту положите каждую салфетку на стерильное бумажное полотенце, чтобы впитать PBS.

Перенесите ткани или органы в отдельную 6-луночную пластину, содержащую 4000 микролитров безглюкозного DMEM, и инкубируйте в течение двух минут. Через две минуты удалите и перенесите ткани в лунки 6-луночного планшета, содержащего 0,29 миллимоляра рабочего раствора FD-глюкозы. Инкубируйте 6-луночные планшеты, содержащие ткани, в рабочем растворе FD-глюкозы при температуре 37 градусов Цельсия.

Соберите по 100 микролитров рабочего раствора FD-глюкозы из каждой лунки после 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минут инкубации и переложите собранные 100 микролитров рабочего раствора FD-глюкозы в 96-луночные планшеты для анализа кинетики внеклеточного истощения FD-глюкозы. Встряхните до и после сбора.

Измерьте флуоресценцию на длинах волн возбуждения и излучения 485 и 535 нанометров соответственно с помощью считывателя микропланшетов.