Измерение сокращения SMC in vitro: неинвазивный метод оценки сокращения гладкомышечных клеток с использованием электрического измерения импеданса клетки-субстрата

Стенка аорты в основном содержит гладкомышечные клетки, или SMC, содержащие сократительные белковые механизмы, которые сокращаются и расслабляются, регулируя кровоток в аорте.

Чтобы измерить сократительную реакцию СМК аорты in vitro, приобретите многолуночный планшет, содержащий матрицу датчиков измерения импеданса электрической ячейки-подложки (ECIS). Каждый массив содержит золотые пленочные электроды на дне скважины, очерченные изоляционной пленкой. Смажьте лунки желатином.

Засейте первичную человеческую суспензию SMC в скважины. Перенесите содержащую ECIS пластину лунки на держатель пластины, подключенный к усилителю и системе сбора данных, обеспечивая при этом контакт электродов с держателем. Подайте небольшой постоянный переменный ток между электродами, чтобы измерить потенциал на них.

Во время инкубации SMC прилипают и распределяются по желатиновому покрытию. Ячейки ведут себя как изоляторы, ограничивая протекание тока между электродами. Чем больше ячеек прикрепляется к поверхности, тем больше поток тока уменьшается. В результате импеданс, или противодействие текущему потоку, и потенциал увеличиваются. В конце концов, клетки разрастаются на электродах и образуют монослой.

Обрабатывайте SMC ионофором кальция, чтобы облегчить транспорт ионов кальция через клеточные мембраны. Внеклеточный приток ионов кальция активирует сократительный аппарат, вызывая сокращение.

Стимулированные SMC сокращаются и теряют межклеточный контакт на электродах. В результате уменьшается покрытие поверхности электрода, уменьшается импеданс, что облегчает количественную оценку сжатия SMC в режиме реального времени.

Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток и засейте SMC в трех экземплярах с плотностью посева 30 000 клеток на лунку в 200 микролитрах среды SMC в пластине ECIS, покрытой желатином. Поместите планшет с SMC в 96-луночный держатель ECIS в инкубаторе для клеточных культур.

Дважды щелкните по «Прикладному биофизическому программному обеспечению ECIS », чтобы открыть программу, и нажмите кнопку «Настройка». Проверьте, все ли электроды имеют контакт с держателем, на левой нижней панели с надписью «Конфигурация скважины». Если электроды подключены неправильно, отрегулируйте пластину в держателе перед началом измерения.

Теперь выберите тип пластины на той же панели, нажав «Тип массива». Далее подготовьте две пипетки, установленные объемом 2 микролитра и 150 микролитров. Перед началом стимуляции нажмите «Отметить» в программном обеспечении, и оставьте комментарий.

Чтобы стимулировать клетки, снимите крышку, и поместите ее на стерильную поверхность внутри инкубатора. Затем вызовите сокращение SMC, как можно быстрее впрыскивая 2 микролитра рабочего раствора иономицина в каждую лунку.

После того, как все клетки будут стимулированы, перемешайте среду в лунках с помощью второй пипетки.