Анализ скользящих актиновых филаментов: анализ подвижности in vitro для изучения транслокации актиновых филаментов на иммобилизованных миозинах

Миозин – моторный белок – взаимодействует с другим нитевидным белком, актином, вызывая его транслокацию.

Чтобы проанализировать скользящее движение актина, соберите проточную камеру на основе стеклянного предметного стекла таким образом, чтобы внутренняя часть верхней части камеры была покрыта нитроцеллюлозой. Протекают через камеру белки миозина, которые обездвиживаются над нитроцеллюлозным покрытием.

Дополните камеру немечеными актиновыми филаментами - черными актинами - и добавьте буфер подвижности, содержащий молекулы аденозинтрифосфата или АТФ.

Актиновые филаменты связываются с иммобилизованными активными миозинами вместе с неактивными или мертвыми миозинами. Молекулы АТФ взаимодействуют с активными миозинами, что приводит к их диссоциации от черных актинов, в то время как неактивные миозины остаются связанными с актинами.

Центрифуга для гранулирования неактивных миозинов присоединяется к черным актинам. Тщательно промойте буфером, чтобы удалить неактивные гранулы миозина, свободные актиновые нити и неиспользованные АТФ. Протекает в флуоресцентно меченых актинах, которые связывают иммобилизованные, активные миозины.

Дополните камеру конечным буфером, содержащим скученный агент