Анализ инвертированной моторики: метод in vitro для визуализации движения миозина на иммобилизованных актиновых филаментах

Миозин – моторный белок – имеет шаровидный домен головки, который взаимодействует с актином – нитевидным белком. Это взаимодействие имеет важное значение для транслокации миозина вдоль актиновых филаментов. Чтобы изучить это связывание in vitro, проведите анализ инвертированной подвижности миозина над поверхностно-привязанным актином.

Для начала соберите пробирную камеру, поместив покровное стекло биотинилированного полиэтиленгликоля с покрытием PEG на предметное стекло микроскопа таким образом, чтобы поверхность с покрытием была обращена внутрь, создавая верхнюю часть камеры.

Пропустите через камеру раствор, содержащий авидин – гликопротеин. Авидин связывается с биотином с высоким сродством, что усиливает адгезию актина. Затем протекайте в меченных биотином актиновых филаментах, помеченных красным флуорофором. Лиганд биотина связывается с авидином, иммобилизуя нити на поверхности покровного стекла.

Наконец, добавьте зеленые флуоресцентные белки миозина 5А, меченные белками, в буфер, содержащий молекулы аденозинтрифосфата, или АТФ. Двухголовый миозин 5А, содержащий замыкающую и ведущую головки, взаимодействует с иммобилизованными актиновыми филаментами. Задняя головка миозина связы