JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:39 мин • July 8th, 2025
Миозин – моторный белок – имеет шаровидный домен головки, который взаимодействует с актином – нитевидным белком. Это взаимодействие имеет важное значение для транслокации миозина вдоль актиновых филаментов. Чтобы изучить это связывание in vitro, проведите анализ инвертированной подвижности миозина над поверхностно-привязанным актином.
Для начала соберите пробирную камеру, поместив покровное стекло биотинилированного полиэтиленгликоля с покрытием PEG на предметное стекло микроскопа таким образом, чтобы поверхность с покрытием была обращена внутрь, создавая верхнюю часть камеры.
Пропустите через камеру раствор, содержащий авидин – гликопротеин. Авидин связывается с биотином с высоким сродством, что усиливает адгезию актина. Затем протекайте в меченных биотином актиновых филаментах, помеченных красным флуорофором. Лиганд биотина связывается с авидином, иммобилизуя нити на поверхности покровного стекла.
Наконец, добавьте зеленые флуоресцентные белки миозина 5А, меченные белками, в буфер, содержащий молекулы аденозинтрифосфата, или АТФ. Двухголовый миозин 5А, содержащий замыкающую и ведущую головки, взаимодействует с иммобилизованными актиновыми филаментами. Задняя головка миозина связывается с АТФ и отделяется от актина.
В результате гидролиза АТФ создается мощный ход, позволяющий замыкающей головке связываться с положением, расположенным перед ведущей головкой вдоль нити накала. Благодаря последовательным силовым движениям миозин движется вдоль обездвиженного актинового волокна, не отрываясь.
С помощью флуоресцентной микроскопии запишите движение молекул зеленого миозина на красных актиновых нитях.
Приготовьте растворы для анализа инвертированной моторики миозина 5а и держите их на льду.
Промойте камеру 10 микролитрами буфера подвижности с DTT. Расход в 10 микролитрах 1 миллиграмм на миллилитр BSA в буфере подвижности с DTT. Повторите это дважды, подождая минуту после третьей стирки. Используйте салфетку или фильтровальную бумагу, чтобы пропустить раствор через канал, аккуратно поместив уголок бумаги на выходе из проточной камеры.
Затем трижды промойте камеру 10 микролитрами буфера подвижности с DTT. Влейте 10 микролитров раствора NeutrAvidin в буфер подвижности с DTT и подождите одну минуту. Затем умойтесь 10 микролитрами этого раствора три раза.
Налейте 10 микролитров bRh-актин-содержащего буфера подвижности с DTT с помощью наконечника пипетки с большим отверстием и подождите одну минуту. Затем трижды умойтесь 10 микролитрами буфера подвижности с DTT.
Влейте 30 микролитров конечного буфера с 10 наномолярным миозином 5а и немедленно загрузите на флуоресцентный микроскоп с полным внутренним отражением. Начните запись после того, как будет найден оптимальный фокус для визуализации TIRF.