Флуоресцентный зондовый визуализирующий анализ: метод визуализации окислительного стресса в культивируемых кишечных органоидных клетках, обработанных индукторами активных форм кислорода

Кишечные органоиды повторяют кишечноподобную организацию крипт-ворсинок, имеющую центральный просвет, состоящий из мертвых клеток и мусора. Просвет выстлан ворсинчатыми клетками и почковающимися, похожими на крипты выступами, содержащими стволовые клетки.

Разные органоидные клетки вырабатывают разное количество активных форм кислорода, АФК – побочных продуктов метаболической активности, накопление которых приводит к окислительному стрессу.

Чтобы визуализировать окислительный стресс в различных клетках, начните с использования многолуночного планшета, содержащего культивируемые 3D-органоиды в базовой матрице. Органоидные стволовые клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок или белок, помеченный GFP, который помогает различать их во время визуализации.

Дополните лунки трет-бутилгидропероксидом - индуктором АФК - и инкубируйте. Индуктор активирует мембраносвязанную NADPH-оксидазу и стимулирует выработку АФК внутри клеток. Стволовые клетки, будучи метаболически активными, продуцируют больше АФК, чем дифференцированные клетки.

Добавьте чувствительные к АФК флюорогенные зонды. Эти липофильные зонды быстро проникают в клетки и вступают в реакцию с АФК, производя красную флуоресценц