Флуоресцентный зондовый визуализирующий анализ: метод визуализации окислительного стресса в культивируемых кишечных органоидных клетках, обработанных индукторами активных форм кислорода

Кишечные органоиды повторяют кишечноподобную организацию крипт-ворсинок, имеющую центральный просвет, состоящий из мертвых клеток и мусора. Просвет выстлан ворсинчатыми клетками и почковающимися, похожими на крипты выступами, содержащими стволовые клетки.

Разные органоидные клетки вырабатывают разное количество активных форм кислорода, АФК – побочных продуктов метаболической активности, накопление которых приводит к окислительному стрессу.

Чтобы визуализировать окислительный стресс в различных клетках, начните с использования многолуночного планшета, содержащего культивируемые 3D-органоиды в базовой матрице. Органоидные стволовые клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок или белок, помеченный GFP, который помогает различать их во время визуализации.

Дополните лунки трет-бутилгидропероксидом - индуктором АФК - и инкубируйте. Индуктор активирует мембраносвязанную NADPH-оксидазу и стимулирует выработку АФК внутри клеток. Стволовые клетки, будучи метаболически активными, продуцируют больше АФК, чем дифференцированные клетки.

Добавьте чувствительные к АФК флюорогенные зонды. Эти липофильные зонды быстро проникают в клетки и вступают в реакцию с АФК, производя красную флуоресценцию. Обработайте органоиды красителем Hoechst, который избирательно окрашивает ядра живых клеток. Визуализируйте органоиды с помощью конфокального микроскопа.

Органоидные клетки на периферии с окрашенными ядрами демонстрируют различную степень красной флуоресценции, которая высока в GFP-экспрессирующих стволовых клетках и низка в дифференцированных клетках. Мертвые клетки с изначально высоким уровнем АФК демонстрируют красную флуоресценцию в просвете.

Интенсивность красной флуоресценции коррелирует с различными уровнями окислительного стресса в различных типах клеток.

Для визуализации окислительного стресса методом конфокальной микроскопии необходимо добавить 1 мкл стокового раствора N-ацетилцистеина в соответствующие лунки микрослайдовой восьмилуночной камеры, покрытой органоидами.

После 1-часовой инкубации добавьте 1 микролитр стокового раствора Трет-бутилгидропероксида в соответствующие лунки, и выдерживайте еще 30 минут. Затем добавьте 1 микролитр 1,25 миллимолярного разведения флуорогенного зонда на лунку, а затем 1 микролитр 1,25 миллиграмма на миллилитр раствора Хёхста.

После еще 30-минутной инкубации удалите среду, не нарушая BMM, и аккуратно добавьте 250 микролитров теплого DMEM без фенолового красного.

Визуализируйте органоиды с помощью конфокального микроскопа, оснащенного термокамерой и подачей газа, которая обнаруживает флуорогенный зонд.

С помощью положительного контроля настройте интенсивность лазера и время воздействия для сигнала АФК, а также проверьте, чтобы этот сигнал был ниже при отрицательном контроле. Затем с помощью окуляра экранируйте предметное стекло, чтобы определить органоиды, выражающие GFP, и отрегулируйте интенсивность лазера.

Установите z-стек размером 25 микрометров и определите положения для получения сшитого изображения всего органоида, чтобы получить сечение органоидов, показывающее один слой клеток.