JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:29 мин • July 8th, 2025
Клетки кишечника продуцируют активные формы кислорода – АФК. Умеренные уровни АФК поддерживают клеточный гомеостаз, в то время как высокие уровни АФК могут вызвать гибель клеток.
Чтобы количественно оценить уровни АФК in vitro, начните с культивирования кишечных 3D-органоидов мыши. Эти органоиды демонстрируют архитектуру кишечного эпителия с криптообразными выступами, содержащими зеленые флуоресцентные стволовые клетки. Они также содержат ворсинчатые дифференцированные клетки на периферии, окружающей центральный просвет, состоящий из мертвых клеток и мусора. Все эти клетки вырабатывают разные уровни АФК.
Теперь обработайте органоиды в предназначенных лунках модуляторами АФК. Исходя из своей природы, модуляторы могут выступать в качестве индукторов или ингибиторов АФК. После инкубации в течение необходимой продолжительности извлеките отработанную среду.
Добавьте в культуру протеолитический фермент, нарушающий 3D-архитектуру органоидов и высвобождающий различные клетки во взвешенном состоянии. Далее добавьте чувствительный к АФК флюорогенный зонд и инкубируйте.
Попадая в клетки, зонды вступают в реакцию с АФК и окисляются, образуя красную флуоресценцию. Обработайте клетки DAPI - ДНК-связывающим флуоресцентным красителем, который избирательно окрашивает ядра мертвых клеток, создавая контраст с живыми клетками.
С помощью проточного цитометра анализируют DAPI-отрицательные живые клетки для получения красного флуоресцентного сигнала, соответствующего уровню их АФК. В зависимости от природы модуляторов, индукторы повышают уровень АФК, в то время как ингибиторы снижают его.
Добавьте 1 микролитр стокового раствора N-ацетилцистеина в отрицательные контрольные лунки 96-луночного планшета с круглым дном, содержащего органоиды.
После 1-часовой инкубации добавьте 1 микролитр стокового раствора Трет-бутилгидропероксида в соответствующие лунки, и выдерживайте в течение 30 минут. Затем с помощью многоканальной пипетки удалите среду, не нарушая прикрепленный BMM, и перенесите ее на другую 96-луночную пластину с круглым дном. Отложите эту тарелку в сторону.
Далее добавьте 100 микролитров трипсина, и с помощью многоканальной пипетки пять раз проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы разрушить BMM. После короткой 5-минутной инкубации диссоциируйте органоиды путем пипетирования вверх и вниз во второй раз.
Вращайте пластину и выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину. Добавьте среду, ранее собранную в другом 96-луночном планшете, обратно в соответствующие лунки и повторно суспендируйте клетки, пипетируя вверх и вниз пять раз.
Далее добавьте 1 микролитр флюорогенного щупа, и выдерживайте в течение 30 минут. Затем снова поверните пластину и снова суспендируйте клетки с 250 микролитрами раствора DAPI. Перенесите образцы в пробирки проточной цитометрии и держите пробирки на льду.
Оптимизируйте настройки напряжения прямого и бокового рассеяния на неокрашенных контрольных и лазерных напряжениях для каждого флуорофора с использованием образцов с одним окрашиванием. Затем, используя подходящую стратегию гейтинга, соберите минимум 20 000 событий.