Анализ проточной цитометрии для количественной оценки окислительного стресса: анализ для количественного определения активных форм кислорода в кишечных органоидах с использованием флуорогенных зондов

Клетки кишечника продуцируют активные формы кислорода – АФК. Умеренные уровни АФК поддерживают клеточный гомеостаз, в то время как высокие уровни АФК могут вызвать гибель клеток.

Чтобы количественно оценить уровни АФК in vitro, начните с культивирования кишечных 3D-органоидов мыши. Эти органоиды демонстрируют архитектуру кишечного эпителия с криптообразными выступами, содержащими зеленые флуоресцентные стволовые клетки. Они также содержат ворсинчатые дифференцированные клетки на периферии, окружающей центральный просвет, состоящий из мертвых клеток и мусора. Все эти клетки вырабатывают разные уровни АФК.

Теперь обработайте органоиды в предназначенных лунках модуляторами АФК. Исходя из своей природы, модуляторы могут выступать в качестве индукторов или ингибиторов АФК. После инкубации в течение необходимой продолжительности извлеките отработанную среду.

Добавьте в культуру протеолитический фермент, нарушающий 3D-архитектуру органоидов и высвобождающий различные клетки во взвешенном состоянии. Далее добавьте чувствительный к АФК флюорогенный зонд и инкубируйте.

Попадая в клетки, зонды вступают в реакцию с АФК и окисляются, образуя красную флуоресценцию. Обработайте клетки DAPI - ДНК-