Анализ SUMOylation: метод in vitro для определения статуса SUMOylation белков субстрата с помощью иммуноблоттинга

СУМОилирование происходит за счет присоединения небольших убиквитин-подобных модификаторов, СУМО, к белкам субстрата.

SUMOилирование происходит, когда зрелый пептид SUMO активируется ферментом - Е1. После активации SUMO переносится на активный центр конъюгирующего фермента - E2 - прикрепляя SUMO к остатку лизина белка субстрата. Другая лигаза - Е3 - повышает эффективность этого взаимодействия.

Чтобы провести анализ SUMOylation in vitro, начните с пробирки, содержащей смесь белка субстрата - p53, ферментов и пептидов SUMO, и инкубируйте для индуцирования SUMOylation. Дополните пробирку додецилсульфатом натрия - SDS-содержащим буфером, завершив реакцию. Нагрейте образец, чтобы денатурировать белки.

Загрузите белковую смесь в лунку геля SDS-PAGE и проведите электрофорез. Более высокомолекулярные SUMOylated белки движутся медленнее, чем их не-SUMOylated варианты, образуя две отдельные полосы.

Перенесите гель на промокательную мембрану, присутствующую на влажной фильтровальной бумаге в электроблоттинг-аппарате. Накройте влажной фильтровальной бумагой и проведите электроперенос белков из геля на мембрану.

Обработайте мембрану антителами против p53, которые связываются с p53. Наложение на фермент-конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с комплексами антитело-p53. Добавьте хемилюминесцентную подложку для получения люминесцентного продукта и визуализируйте мембрану.

Более высокая молекулярная масса соответствует SUMOylated белкам, в то время как нижняя полоса соответствует неSUMOylated белковым вариантам.

Добавьте 3 микролитра 100 нанограмм на микролитр очищенного tag-K-bZIP в реакцию мастер-микса in vitro SUMOylation. Затем аккуратно перемешайте содержимое мастер-смеси и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия в течение 3 часов.

Далее добавляем 20 микролитров 2x SDS-PAGE с буфером загрузки для остановки реакции. Затем нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение 5 минут, чтобы денатурировать белок.

Затем загрузите 20 микролитров образца в 10% гель SDS-PAGE и запустите гель при напряжении 80 вольт в течение примерно 120 минут, пока краситель не достигнет дна геля.

После окончания электрофореза отсоедините гелевый аппарат и перенесите гель в полусухой буфер для переноса на 5 минут. Затем замочите мембрану PVDF в другой емкости, наполненной метанолом, на 1 минуту.

Снимите мембрану PVDF с метанола и замочите в полусухом буфере для переноса. Затем аккуратно помешивайте мембрану в течение 5 минут.

Снимите предохранительную крышку полусухого электрофоретического аппарата. Предварительно намочите фильтровальную бумагу, а на дно платинового анода приготовьте гелевый бутерброд. Закрепив катодную пластину в защитной крышке, запустите кляксу при постоянном токе 15 вольт в течение 90 минут. Затем выключите блок питания и выньте мембрану PVDF, предварительно отсоединив полусухой аппарат.

Теперь заблокируйте мембрану из ПВДФ блокирующим буфером на 1 час при комнатной температуре на орбитальном вибростенде со скоростью 30 оборотов в минуту. Затем гибридизуют мембрану PVDF с антителом против p53 и блокирующим буфером в течение 12-16 часов при температуре 4 градуса Цельсия на смесителе суспензии со скоростью 30 оборотов в минуту.

Затем извлеките мембрану из ПВДФ и переложите в контейнер, наполненный ТРИС-буферным физиологическим раствором с Tween-20. Затем замочите мембрану из ПВДФ в ТРИС-буферном физрастворе с помощью Tween-20 на 30 минут на орбитальном вибростенде со скоростью 45 оборотов в минуту. Затем гибридизируют мембрану PVDF с антителом против кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена, разведенной в блокирующем буфере, в течение 1 часа при комнатной температуре на смесителе суспензий со скоростью 30 оборотов в минуту.

Далее трижды промойте мембрану из ПВДФ с TRIS-буферным физиологическим раствором Tween-20. После промывки замочите мембрану PVDF в TRIS-буферизованном физрастворе Tween-20 на 30 минут на смесителе для суспензий со скоростью 45 оборотов в минуту. Затем замените TRIS-буферизованный физиологический раствор Tween-20 на фосфатно-солевой буфер, чтобы сохранить мембрану PVDF при температуре 4 градуса Цельсия на срок до 12 часов.

Затем смешайте усиленные хемилюминесцентные реагенты подложки 1 и 2 в соотношении 1:1. Затем снимите мембрану PVDF с фосфатно-солевого буфера и кратковременно промокните карманами для пунша, чтобы впитать лишнюю влагу.

Сразу же добавьте 400 микролитров хемилюминесцентного реагента на поверхность мембраны и подождите от 3 до 5 минут. Кратковременно промокните, чтобы слить излишки хемилюминесцентного реагента, не допуская полного высыхания мембраны. Используйте люминесцентную систему визуализации, чтобы обнажить блот