JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:03 мин • July 8th, 2025
Клеточный белковый гомеостаз, или протеостаз, включает в себя регуляцию сворачивания и функции белка, а также деградацию неправильно свернутых белков. Во время старения механизм протеостаза ослабевает, в результате чего неправильно свернутые белки накапливаются и далее агрегируются, что приводит к клеточной дисфункции.
Чтобы определить возрастное снижение протеостаза, начните с синхронизированных по развитию, взрослых трансгенных Caenorhabditis elegans.
Мышечные клетки этих червей экспрессируют белки с аномально расширенным полиглутамином, или polyQ, повторами, слитыми с флуоресцентной меткой. Белки PolyQ склонны к неправильному сворачиванию и, следовательно, при накоплении могут образовывать агрегаты.
Перенесите червей на предметное стекло микроскопа, состоящее из агарозной прокладки, и иммобилизуйте с помощью подходящего химического вещества для визуализации живых клеток. Используя флуоресцентный микроскоп, визуализируйте мышцы стенки тела червей в течение определенного периода времени, чтобы определить яркие сигналы флуоресцентных очагов, соответствующие флуоресцентным агрегатам polyQ.
В течение нескольких дней, в связи с возрастным снижением протеоостаза, происходит прогрессирующее накопление агрегата polyQ, что приводит к увеличению количества флуоресцентных очагов. Повышенное количество агрегатов polyQ в мышечных клетках вызывает токсичность и нарушает функцию мышечных клеток, что приводит к параличу.
Под микроскопом запишите количество живых парализованных червей, лишенных движения при воздействии механических раздражителей. Повышенная частота паралича червей предполагает возрастной протеостаз, снижение мышечной ткани у червей.
Чтобы измерить снижение протеостаза в мышечной ткани, выберите 20 животных и закрепите их на предметном стекле микроскопа с 3% агарозной прокладкой и каплей 5 микролитров 10-миллимолярного азида натрия.
После того, как все черви обездвижены, сфотографируйте все тела животных с помощью линзы с 10-кратным увеличением. Используйте фильтр FITC или YFP и одинаковую экспозицию для каждого животного. Когда закончите, выбросьте слайды.
Посчитайте количество очагов в мышцах стенки тела всего животного. Фокусы — это более яркие, пунктуированные сигналы, которые можно отличить от более тусклого растворимого сигнала на заднем плане.
В дни подсчета очков посмотрите на таблички с животными и запишите количество парализованных животных. Затем извлеките парализованных животных из тарелки.
По завершении эксперимента рассчитайте частоту паралича для каждого состояния и наметьте прогрессирование паралича.