Амплиментированный люминесцентный близости-гомогенный анализ: бесконтактный анализ на основе гранул для скрининга малых молекул, ингибирующих белок-белковые взаимодействия

В биологических системах близость белка к его конкретному партнеру является решающим фактором, определяющим успешное белок-белковое взаимодействие. При наличии небольших ингибирующих молекул эти белки не могут двигаться рядом друг с другом, нарушая свои взаимодействия.

Для скрининга ингибирующих молекул на предмет нарушения взаимодействий между двумя белками – шапероном и ко-шапероном – берут многолуночный планшет, содержащий различные малые молекулы. Дополните лунки донорскими бусинами, к поверхности которых прикреплены со-шапероны. Эти шарики содержат фотосенсибилизаторы для хемилюминесцентного анализа.

Добавьте суспензию акцепторных шариков, конъюгированных с пептидными последовательностями, полученными из шаперона, которые специфически связываются с ко-шапероном. Шарики содержат краситель на основе тиоксена и флуорофоры, необходимые для визуализации.

В лунках с неингибирующими молекулами высокое сродство между шаперон-связывающими пептидами и ко-шаперонами привлекает акцепторные и донорские шарики. В то время как бусины остаются на расстоянии при присутствии ингибиторов.

С помощью хемилюминесцентного ридера изучите взаимодействие. При освещении на определенной длине волны фотосенсибилизаторы-доноры выделяют высокореактивные синглетные кислороды.

Не имея ингибирующих молекул, испускаемые вещества достигают близко расположенных акцепторных бусин и вступают в реакцию с молекулами красителя, вызывая хемилюминесценцию. Эта энергия активирует флуорофоры акцепторных бусин, вызывая излучение света.

Напротив, в лунках с ингибирующими молекулами синглетные кислороды претерпевают распад, что приводит к отсутствию светового излучения, что свидетельствует об успешном ингибировании белок-белковых взаимодействий.

Добавьте донорские гранулы глутатиона в концентрации 10 микрограмм на миллилитр в PBS. Добавьте GST-FKBP51 до конечной концентрации 10 микрограммов на миллилитр и инкубируйте реакцию в течение 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия в темноте.

Производить последовательные разведения исследуемого соединения в ДМСО. Добавьте 0,25 микролитра тестового соединения в трех экземплярах, в угол каждой лунки 384-луночного планшета.

Для отрицательного контроля добавьте 0,25 микролитра ДМСО, а для положительного контроля добавьте в лунки 0,25 микролитра Hsp90 C-концевого пептида.

Добавьте в каждую лунку по 22,5 микролитра раствора, содержащего донорские гранулы глутатиона с белками, помеченными GST. Тщательно встряхните тарелку руками и выдержите в темноте при температуре 25 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Разбавьте акцепторные шарики с прикрепленным С-концевым пептидом Hsp90 до 100 мкг на миллилитр в 0,5x PBS. Добавьте в каждую лунку по 2,25 микролитра разведенных акцепторных шариков. Встряхните и выдержите тарелку в темноте в течение 15 минут, как показано на рисунке.

Включите прибор для чтения пластин, измерьте сигнал пластины и проанализируйте данные, как описано в рукописи текста.