Анализ вирусных бляшек: метод измерения инфекционного вируса простого герпеса путем количественной оценки бляшек, образующихся в монослое инфицированных вирусом клеток

Для начала приготовьте серийные разведения вируса простого герпеса, оболочечного инфекционного вируса, в буфере.

Получить многолуночный планшет, содержащий монослой вирус-чувствительной культуры эпителиальных клеток. Заменяйте определенный объем среды разбавленными вирусными суспензиями, обеспечивая равномерное покрытие монослоя. Дайте вирусу адсорбироваться на поверхности клеток.

Удалите все неадсорбированные вирусы. Покройте монослой ячейки метилцеллюлозсодержащей средой, образуя полутвердое покрытие.

После инкубации вирусная оболочка и клеточная мембрана сливаются, высвобождая вирусный нуклеокапсид, заключающий в себе двухцепочечный геном, в цитоплазму. Далее вирусный геном высвобождается в ядро клетки.

Используя клеточный механизм хозяина и белок вириона, вирусный геном экспрессирует немедленные ранние вирусные белки, которые регулируют экспрессию ранних генов. Ранние вирусные белки опосредуют репликацию вирусной ДНК.

Затем поздние вирусные гены экспрессируют структурные белки, которые вместе с вирусным геномом собираются для производства частиц вирионов для потомков. Инфицированные вирусом клетки лизируются, высвобождая вирионы.

Метилцеллюлоза ограничивает движение вируса, в результате чего вирионы заражают только соседние клетки и последующий лизис, создавая дыры в монослое.

После инкубации удалите метилцеллюлозную накладку. Добавьте этаноловый кристаллический раствор фиалки. Этанол фиксирует клетки и инактивирует вирусы, в то время как кристаллический фиолетовый окрашивает клетки. В результате на монослое фиолетовых клеток появляются четкие лизированные зоны или бляшки.

Подсчитайте количество бляшек в каждой лунке при каждом разведении вируса, чтобы определить титр или концентрацию инфекционного вируса.

Удалите питательную среду для клеточных клеток из одной или двух лунок с помощью пипетки. Осторожно добавьте разведенный образец вируса по каплям в каждый монослой клеток, по капле через стенки каждой лунки.

Повторяйте процесс для каждой одной или двух лунок до тех пор, пока вся пластина не будет заполнена образцами вируса. Аккуратно покачивайте всю тарелку вручную.

Затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа, чтобы вирус мог адсорбироваться. Каждые 10 минут вынимайте пластину из инкубатора, осторожно покачивайте ее снова, чтобы вирус более равномерно распределился по каждой лунке, а затем поместите обратно в инкубатор.

Чтобы уменьшить вероятность случайного подсчета неабсорбированного инокулята, удалите образец вируса из лунок с помощью наконечника для пипетки объемом 1000 микролитров и выбросьте образец в стакан для отходов.

Поместите на тарелку 2,5 миллилитра накладки из метилцеллюлозы, и поместите ее обратно в инкубатор. Продезинфицируйте стакан для отходов, как правило, с добавлением отбеливателя, йодофора или аналогичного вироцида, прежде чем вынимать его из шкафа биобезопасности.

После двухдневной инкубации с помощью пипетки удалите слой метилцеллюлозы из одной или двух лунок и поместите его в стакан для отходов. Добавьте в каждую лунку примерно 2 миллилитра 1% кристаллического фиолетового и 50% этанола. Инкубируйте тарелку со всеми лунками, заполненными морилкой, в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

На этом этапе продезинфицируйте стакан для отходов, как было показано ранее. Энергично промойте пластины водой из-под крана, пока сток не станет прозрачным.

Убедитесь, что количество бляшек в каждой серии разведения примерно в 10 раз отличается.