Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 5:32 мин. • July 8th, 2025
Инфицированные микробными патогенами клетки-хозяева подвергаются апоптозу – запрограммированной гибели клеток. Во время апоптоза ДНКазы расщепляют хромосомную ДНК на мелкие фрагменты, что приводит к гибели клеток.
Для выявления апоптоза с помощью теста TUNEL берут предметное стекло с депарафинизированным и регидратированным участком кожной ткани, зараженным грибковым возбудителем.
Обработайте ткань протеиназой-К, чтобы инактивировать клеточные ДНКазы, предотвращая их потенциальную деградацию ДНК во время анализа. Добавьте перекись водорода, чтобы погасить реакцию, и промойте предметное стекло, чтобы удалить непрореагировавшую протеиназу-К.
Добавьте буфер, содержащий меченые дигоксигенином дезоксиуридинтрифосфаты, или dUTP. Дополните его терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой, ферментом TdT и инкубируйте. В апоптотических клетках фермент TdT катализирует прикрепление меченых dUTP к обнаженным 3'-гидроксильным группам фрагментированной ДНК.
Затем добавьте антитело против дигоксигенина, конъюгированное с родаминовым репортером, и инкубируйте его в темноте, чтобы облегчить связывание антител с мечеными дигоксигенином dUTP, придавая красную флуоресценцию при визуализации.
Обработайте образцы тканей флуоресцентным ядерным противокрасителем, чтобы визуализировать ядра. Наденьте покровную трубку на участок ткани и визуализируйте его под флуоресцентным микроскопом.
Синяя флуоресценция помогает идентифицировать ядра всех клеток в тканевом отделе, в то время как наличие красной флуоресценции в клетках, окрашенных родамином, указывает на фрагментацию ДНК из-за апоптоза.
Чтобы начать эту процедуру, подготовьте гидрофильные стеклянные стекла с образцом ткани, как указано в текстовом протоколе.
Чтобы депарафинизировать участки ткани, промойте слайды трижды ксилолом, по 5 минут каждая, в банке с коплином. Далее промойте горки со 100% этанолом два раза по 5 минут каждый. После этого промойте слайды с 95% этанолом и 70% этанолом в течение 3 минут каждая, затем промойте слайды один раз PBS в течение 5 минут.
Для подготовки экспериментальных и отрицательных контрольных стекол предварительно обработайте ткань, добавив свежеразведенную протеиназу К непосредственно на предметные стекла. Выдержите слайды в течение 10 минут при комнатной температуре, затем промойте слайды в PBS два раза по 2 минуты каждая.
Для приготовления предметных стекол для положительного контроля предварительно обработайте ткань DN-буфером, затем инкубируйте стекла при комнатной температуре в течение 5 минут. После этого растворяют ДНКазу I в ДНК-буфере до конечной концентрации 0,1 мкг на миллилитр. Добавьте приготовленный раствор ДНК на предметные стекла. Выдержите горки в течение 15 минут при комнатной температуре, затем промойте бока дистиллированной водой в банке с коплином пять раз, по 3 минуты каждая.
Погасите реакцию в 3% перекиси водорода в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре. Далее промойте слайды в PBS два раза по две минуты каждый. Затем добавьте равновесный буфер в ткань на предметных стеклах. Инкубируйте в течение 10 секунд при комнатной температуре, затем сотрите лишнюю жидкость вокруг участка ткани.
Разведите терминальный фермент дезоксинуклеотидилтрансферазу в реакционном буфере, затем добавьте его в ткань на экспериментальных и положительных предметных стеклах. Выдерживать в увлажненной камере в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия.
После этого поместите предметные стекла в банку с коплином, содержащую рабочую концентрацию стопорного буфера. Помешивайте в течение 15 секунд, а затем выдерживайте предметные стекла при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем промойте предметные стекла PBS три раза по 1 минуте каждый раз и сотрите лишнюю жидкость.
Далее добавьте предварительно подогретый до комнатной температуры конъюгат антидигоксигенин непосредственно на ткань. Выдержите предметные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре во увлажненной темной камере.
После завершения инкубации промойте предметные стекла PBS четыре раза по две минуты каждый. Стряхните лишнюю жидкость. Затем добавьте монтажную среду по бокам. Добавьте 15 микролитров раствора DAPI в монтажную среду на предметных стеклах. Накройте каждую горку покровным стеклом и заклейте лаком для ногтей. Дайте предметным стеклам высохнуть в темноте.
С помощью флуоресцентного микроскопа наблюдайте за предметными стеклами сразу после завершения процесса окрашивания.
Делайте фотографии 400 раз через случайные промежутки времени вдоль каждого участка кожи. Подсчитайте окрашенные DAPI синие клетки, чтобы убедиться, что видно не менее 100 клеток на участке кожи на одно животное. Затем подсчитайте количество TUNEL-положительных клеток, которые выглядят как красные одиночные клетки с четкими краями.