Терминальная трансфераза-опосредованная мечение Nick Nick End-Labeling — анализ TUNEL: метод in situ для обнаружения фрагментации ДНК в апоптотических клетках

Инфицированные микробными патогенами клетки-хозяева подвергаются апоптозу – запрограммированной гибели клеток. Во время апоптоза ДНКазы расщепляют хромосомную ДНК на мелкие фрагменты, что приводит к гибели клеток.

Для выявления апоптоза с помощью теста TUNEL берут предметное стекло с депарафинизированным и регидратированным участком кожной ткани, зараженным грибковым возбудителем.

Обработайте ткань протеиназой-К, чтобы инактивировать клеточные ДНКазы, предотвращая их потенциальную деградацию ДНК во время анализа. Добавьте перекись водорода, чтобы погасить реакцию, и промойте предметное стекло, чтобы удалить непрореагировавшую протеиназу-К.

Добавьте буфер, содержащий меченые дигоксигенином дезоксиуридинтрифосфаты, или dUTP. Дополните его терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой, ферментом TdT и инкубируйте. В апоптотических клетках фермент TdT катализирует прикрепление меченых dUTP к обнаженным 3'-гидроксильным группам фрагментированной ДНК.

Затем добавьте антитело против дигоксигенина, конъюгированное с родаминовым репортером, и инкубируйте его в темноте, чтобы облегчить связывание антител с мечеными дигоксигенином dUTP, придавая красную флуоресценцию при визуализации.

Обработай