JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 2:54 мин • July 8th, 2025
Каспаза-3 и каспаза-7 представляют собой протеазы, которые распознают последовательность тетрапептида DEVD в белках-мишенях, расщепляя их на С-конце остатка аспарагиновой кислоты. Они играют заметную роль в каскаде апоптоза - запрограммированной клеточной смерти.
Чтобы оценить активность каспазы-3/7 в апоптотических клетках, начните с пробирки, содержащей эксплант кожи лягушачьего пальца ноги, зараженный грибами, вызывающими апоптоз. Добавьте в трубку подходящий буфер и несколько металлических шариков.
Используйте взбивание шариков, чтобы разрушить клетки кожи и высвободить клеточное содержимое, включая белки каспазы-3/7. Центрифугируйте пробирку, гранулируя остатки клеток и органеллы. Аспирируйте богатую белком надосадочную жидкость из пробирки и пипетки в лунки многолуночного аналитического планшета.
Дополните лунки люминогенным реагентом каспазой. Этот реагент состоит из пролюминесцентной субстраты, содержащей пептид DEVD в буферном растворе, содержащем АТФ, ионы магния и фермент люциферазу.
Перемешайте содержимое лунки и инкубируйте. Во время инкубации каспазы-3/7 расщепляют пролюминесцентный субстрат, высвобождая в раствор аминолюциферин – субстрат для люциферазы.
В присутствии ионов АТФ и магния люцифераза окисляет высвобожденный аминолюциферин, образуя биолюминесцентный продукт. Количество света, производимого во время реакции, пропорционально активности каспазы.
Чтобы извлечь белки из замороженного образца лягушачьего пальца, поместите образец в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 100 микролитров буфера для образца и две бусины из нержавеющей стали.
Используйте взбиватель для бусин на максимальной скорости для лизирования клеток. После этого поместите пробирку на лед на 3 минуты, затем центрифугируйте пробирку для сбора надосадочной жидкости.
Чтобы провести анализ каспазы 3/7 в 384-луночном планшете, добавьте 10 микролитров буфера для образца в виде заготовки и 10 микролитров экстракта белка в трех экземплярах. Затем пипеткой нанесите 10 микролитров коммерчески доступного реагента каспазы 3/7 в белковый экстракт и пустые лунки. Затем осторожно встряхните пластину в течение 15 секунд, чтобы смешать два реагента.
Выдерживать при комнатной температуре и темноте в течение 30 минут. Наконец, используйте люминесцентный считыватель пластин для измерения люминесценции образца.