Анализ фагоцитоза: метод иммуноокрашивания для визуализации поглощения апоптотических клеток в эмбриональных клетках Drosophila melanogaster

Макрофаги — это специализированные иммунные клетки, которые очищают клетки, подвергающиеся апоптозу — запрограммированной гибели клеток в результате фагоцитоза.

Чтобы оценить поглощение апоптотических клеток, начните со предметного стекла, содержащего неподвижные эмбриональные клетки дрозофилы, в том числе апоптотические тельца, поглощенные гемоцитами - макрофагами беспозвоночных.

Во-первых, обработайте клетки блокирующим реагентом, который блокирует неспецифические участки. Добавьте первичные антитела, связывающие рецепторы крокеморта – фагоцитарные маркеры гемоцитов. Смойте излишки антител.

Добавьте меченные щелочной фосфатазой вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами. Теперь добавьте соответствующий раствор хромогенного субстрата на предметное стекло и инкубируйте. Во время инкубации щелочная фосфатаза вступает в реакцию с хромогенным субстратом с образованием гранул с фиолетовым окрасом в гемоцитах.

Затем добавьте реакционную смесь, содержащую терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу, фермент TdT и нуклеотиды, связанные с дигоксигенином. TdT катализирует присоединение дигоксигенин-связанных нуклеотидов к обнаженным 3'-OH-концам фрагментированной ДНК в а