Анализ фагоцитоза: метод иммуноокрашивания для визуализации поглощения апоптотических клеток в эмбриональных клетках Drosophila melanogaster

Макрофаги — это специализированные иммунные клетки, которые очищают клетки, подвергающиеся апоптозу — запрограммированной гибели клеток в результате фагоцитоза.

Чтобы оценить поглощение апоптотических клеток, начните со предметного стекла, содержащего неподвижные эмбриональные клетки дрозофилы, в том числе апоптотические тельца, поглощенные гемоцитами - макрофагами беспозвоночных.

Во-первых, обработайте клетки блокирующим реагентом, который блокирует неспецифические участки. Добавьте первичные антитела, связывающие рецепторы крокеморта – фагоцитарные маркеры гемоцитов. Смойте излишки антител.

Добавьте меченные щелочной фосфатазой вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами. Теперь добавьте соответствующий раствор хромогенного субстрата на предметное стекло и инкубируйте. Во время инкубации щелочная фосфатаза вступает в реакцию с хромогенным субстратом с образованием гранул с фиолетовым окрасом в гемоцитах.

Затем добавьте реакционную смесь, содержащую терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу, фермент TdT и нуклеотиды, связанные с дигоксигенином. TdT катализирует присоединение дигоксигенин-связанных нуклеотидов к обнаженным 3'-OH-концам фрагментированной ДНК в апоптотических тельцах.

Затем добавьте антидигоксигениновые антитела, конъюгированные с пероксидазным репортером, которые связываются с нуклеотидами в месте повреждения ДНК. Обработайте клетки раствором хромогенного субстрата, специфичным для пероксидазы, и инкубируйте. Пероксидаза катализирует окисление субстрата, образуя цветные осадки и окрашивая апоптотические тела в коричневый цвет.

Наконец, визуализируйте клетки под световым микроскопом. Одновременное присутствие фиолетовых гранул и коричневых сигналов от клеток указывает на гемоциты, содержащие фагоцитированные апоптотические тельца.

Чтобы иммуноокрашивать клетки антителами против Крокеморта, сначала последовательно замачивают предметное стекло в метаноле, затем PBS добавляют 0,2% Triton X-100, а затем только PBS. Далее блокируют неспецифическое связывание 20 микролитрами 5% цельной сыворотки свиней в PBS + 0,2% Triton X-100, на 20 минут при комнатной температуре. Удалите излишки блокирующего раствора и пометьте клетки 20 микролитрами антикрокемортской антисыворотки при температуре 4 градуса Цельсия на ночь.

На следующее утро промойте предметное стекло в PBS + Triton X-100 в течение пяти 10-минутных инкубаций. После последней стирки промойте предметное стекло в PBS в течение 10 минут. Затем пометьте клетки 20 микролитрами меченного щелочной фосфатазой антикрысиного IgG при комнатной температуре в течение 1 часа.

В конце инкубации пять раз промойте предметное стекло в PBS + Triton X-100, как показано на рисунке, с последующим 10-минутным замачиванием в буферном растворе. Затем пометьте клетки раствором субстрата фосфатазы и понаблюдайте за клетками под световым микроскопом.

Когда в гранулах гемоцитов появятся сильные фиолетовые сигналы, удалите излишки субстрата и замочите предметное стекло в буфере с добавлением ЭДТА на 5-10 минут. В конце инкубации промойте клетки двумя 5-минутными промывками PBS и обработайте их уравновешивающим буфером в течение 10 минут.

После удаления раствора пометьте клетки 20 микролитрами раствора терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа. Затем достаньте раствор из предметного стекла, и замочите ячейки в 0,5 миллилитрах стоп-буфера в 17 миллилитрах воды, на 10 минут. Затем промойте клетки тремя 5-минутными промывками PBS и пометьте их 20 микролитрами антидигоксигенинпероксидазы в течение 30 минут при комнатной температуре.

В конце инкубации промойте клетки четыре раза в PBS, как показано на рисунке, и замочите предметное стекло в пероксидазном субстрате на 30 секунд, пока апоптотические клетки не станут коричневыми. Когда будет достигнуто оптимальное окрашивание, замочите предметное стекло в воде, чтобы остановить реакцию пероксидазы.