Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 4:57 мин. • July 8th, 2025
Клетки, подвергающиеся апоптозу - запрограммированной клеточной смерти - отображают на своей поверхности сигналы «ешьте меня», способствуя деградации фагоцитами - специализированными иммунными клетками. Этот процесс очищения апоптотических клеток называется эффероцитозом.
Для проведения анализа на эффероцитоз сначала берут суспензию апоптотических клеток с двойным окрашиванием. Поверхности этих клеток помечаются биотином, а цитоплазма помечается красителем, отслеживающим клетки, помечая материалы, полученные из апоптотических клеток.
Добавьте клеточную суспензию в культуру адгезивных макрофагальных клеток, которые функционируют как эффероциты. Центрифугирует, форсируя контакт между макрофагами и апоптотическими клетками, и инкубирует.
Эффероцитарные рецепторы на макрофагах связываются с фосфатидилсерином - сигналом «съешь меня» - на мембране апоптотической клетки, способствуя его поглощению. Небольшие фрагменты апоптотической клетки захватываются внутри мембранного везикулы, называемого эфферосомой.
В результате получается эффероцитированная фракция - часть апоптотической клетки внутри макрофага - и неэффероцитированная фракция - неинтернализованная часть апоптотической клетки.
Добавьте флуоресцентно меченный стрептавидин, который связывается с экспонированными молекулами биотина на поверхности неэффероцитированной фракции, дифференцируя неинтернализованные и интернализованные части апоптотической клетки.
Под флуоресцентным микроскопом неинтернализованная фракция апоптотических клеток демонстрирует мечение стрептавидина, в то время как эфферосомы выглядят как дискретные точки, свободные от стрептавидина.
Чтобы количественно оценить эффероцитоз, определите количество дискретных эфферосом и измерьте интенсивность эффероцитированных и неэффероцитированных фракций апоптотических клеток.
После подготовки макрофагов человека и апоптотических клеток Юрката используйте гемоцитометр для подсчета апоптотических клеток. Затем перенесите достаточное количество апоптотических клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.
Гранулируйте клетки Jurkat с помощью центрифугирования в 500 раз больше g в течение 5 минут. Затем повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах PBS. Пока ячейки Jurkat находятся в центрифуге, залейте 10 микролитров ДМСО в новую микроцентрифужную пробирку.
Затем растворите минимальное количество NHS-биотина в ДМСО. После этого перенесите 500 микролитров апоптотической клетки и суспензии PBS в пробирку, содержащую ДМСО и NHS-биотин. Затем разведите соответствующий краситель для отслеживания клеток в соответствии с инструкциями производителя.
Инкубируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте. Затем добавьте равный объем RPMI 1640 с 10% FBS и выдержите суспензию при комнатной температуре в темноте еще 5 минут.
После этого гранулируйте клетки центрифугированием в 500 раз больше g в течение 5 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте окрашенные клетки в 100 микролитрах RPMI 1640 с 10% FBS. Добавьте по 100 микролитров окрашенной клеточной суспензии по каплям в каждую лунку макрофагов. Затем центрифугируйте планшет в 200 раз g в течение 1 минуты. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5%CO2 в инкубаторе для культуры тканей.
По истечении соответствующего инкубационного периода извлеките клетки из инкубатора. Затем дважды промойте клетки 1 миллилитром PBS. После этого в каждую лунку добавьте разведенный ФИТК-конъюгированный стрептавидин и выдержите тарелку в течение 20 минут в темноте.
Промойте клетки три раза 1 миллилитром PBS, и аккуратно встряхивайте образцы в течение 5 минут после каждого полоскания. Затем зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в PBS на 20 минут при комнатной температуре. Промойте клетки один раз PBS, чтобы удалить избыток PFA.
Закрепите покровные стекла на предметном стекле и перенесите предметное стекло на флуоресцентный микроскоп. Захват z-стеков достаточного количества ячеек для количественной оценки.