Репортерный анализ одного ооцита in vitro: метод изучения регуляции трансляции мРНК-мишени во время созревания ооцитов in vitro

Ооциты в профазе-I мейоза транскрипционно активны; они продуцируют мРНК и хранят их в спящей форме. Во время созревания, когда ооцит входит в метафазу, накопленные мРНК транслируются в белки.

Чтобы изучить трансляцию мРНК, начинают с профазы-I-задержанных мышиных ооцитов, взвешенных в капле среды. Расположите удерживающий пипетку рядом с одним ооцитом, чтобы удерживать его в нужном положении.

Возьмите пипетку для микроинъекций, содержащую репортерную смесь. Эта смесь содержит два различных типа мРНК, один из которых кодирует желтый флуоресцентный белок, или YFP - репортер, слитый с 3'-нетранслируемой областью гена-мишени, и полиаденилированную мРНК, кодирующую красный флуоресцентный белок.

Введите репортерную смесь в яйцеклетку. Инкубируйте микроинъецированные ооциты в среду для созревания с добавлением цилостамида - химического ингибитора, поддерживающего арест профазы-I.

Ооцит транслирует полиаденилированную мРНК до тех пор, пока интенсивность красной флуоресценции не достигнет плато, в то время как уровни YFP-кодирующей мРНК без хвоста полиаденилирования остаются таковыми.

Перенесите обработанные ооциты в среду созревания без цилостамида, что способствует возобновлению мейоза; и