Репортерный анализ одного ооцита in vitro: метод изучения регуляции трансляции мРНК-мишени во время созревания ооцитов in vitro

Ооциты в профазе-I мейоза транскрипционно активны; они продуцируют мРНК и хранят их в спящей форме. Во время созревания, когда ооцит входит в метафазу, накопленные мРНК транслируются в белки.

Чтобы изучить трансляцию мРНК, начинают с профазы-I-задержанных мышиных ооцитов, взвешенных в капле среды. Расположите удерживающий пипетку рядом с одним ооцитом, чтобы удерживать его в нужном положении.

Возьмите пипетку для микроинъекций, содержащую репортерную смесь. Эта смесь содержит два различных типа мРНК, один из которых кодирует желтый флуоресцентный белок, или YFP - репортер, слитый с 3'-нетранслируемой областью гена-мишени, и полиаденилированную мРНК, кодирующую красный флуоресцентный белок.

Введите репортерную смесь в яйцеклетку. Инкубируйте микроинъецированные ооциты в среду для созревания с добавлением цилостамида - химического ингибитора, поддерживающего арест профазы-I.

Ооцит транслирует полиаденилированную мРНК до тех пор, пока интенсивность красной флуоресценции не достигнет плато, в то время как уровни YFP-кодирующей мРНК без хвоста полиаденилирования остаются таковыми.

Перенесите обработанные ооциты в среду созревания без цилостамида, что способствует возобновлению мейоза; и целевая мРНК претерпит трансляцию для производства целевого белка, слитого с желтым флуоресцентным репортером.

Выполняйте покадровую съемку для визуализации сигналов флуоресценции через равные промежутки времени.

Введенные ооциты демонстрируют постоянный уровень красной флуоресценции, в то время как желтая флуоресценция со временем увеличивается, что указывает на трансляцию и постепенное накопление репортерных белков.

Для начала осторожно вскройте антральные фолликулы, сделав небольшой надрез в стенке фолликула иглой 26 калибра. Выделите неповрежденные КОК с несколькими слоями кучевых клеток с помощью стеклянной пипетки с ротовым управлением. Используйте пипетку меньшего размера и механически обнажайте КОК путем повторного пипетирования.

Отсадите оголенные ооциты и поместите их в чашку Петри со средой для созревания с добавлением 1 микромоляра цилостамида. Поместите чашку в инкубатор на два часа, чтобы дать ооцитам восстановиться от стресса, вызванного их выделением из фолликулов.

Поместите капиллярную трубку из боросиликатного стекла длиной 10 сантиметров и механический пуллер для подготовки инъекционных игл. Согните кончик иглы под углом 45 градусов с помощью нагретой нити для оптимального впрыска. Поместите 20-микролитровые капли основной среды для сбора ооцитов в полистирольную посуду и залейте капли легким минеральным маслом.

Приготовьте больший объем репортерной смеси, добавив по 12,5 мкг на микролитр Ypet UTR и mCherry. Храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После размораживания центрифугируйте аликвоту в течение двух минут при температуре 20 000 x g. Затем переложите ее в новую микроцентрифужную пробирку.

Загрузите в иглу для инъекций примерно 0,5 микролитра смеси репортера. Поместите пипетку и иглу для инъекций в держатели и поместите их в каплю среды для сбора ооцитов.

Откройте иглу для инъекций, осторожно постучав ею по удерживающей пипетке. Поместите ооциты в каплю основной среды для сбора и введите от 5 до 10 пиколитров смеси. Инкубируйте ооциты в среде созревания с 1 микромолярным цилостамидом в течение 16 часов, чтобы сигнал mCherry вышел на плато.

Для покадровой микроскопии приготовьте чашку Петри с двумя каплями среды для созревания по 20 микролитров для каждого введенного репортера. Одна капля с 1 микромолярным цилостамидом для контроля профазы I-задержанных ооцитов и одна капля без цилостамида для созревающих ооцитов. Замажьте капельки легким минеральным маслом, и поместите их в инкубатор.

После предварительной инкубации введенные ооциты извлечь из инкубатора, и четыре раза промыть их в среде созревания без цилостамида. Некоторые ооциты содержат в среде созревания с 1 микромолярным цилостамидом в качестве контрольной группы ооцитов профазы I.

Перенесите введенные ооциты в соответствующие капли на заранее подготовленной чашке для покадровой съемки микроскопа. Кластеризуйте ооциты с помощью закрытой стеклянной пипетки, чтобы предотвратить их движение во время записи.

Поместите тарелку под микроскоп, оснащенный светодиодной системой освещения, и моторизованный столик с климатической камерой, поддерживающей температуру 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, используя параметры, указанные в рукописи текста.

Введите соответствующие настройки для эксперимента с интервальной съемкой, нажав «Приложения», а затем «Многомерное извлечение». Выберите первую вкладку «Основная» и выберите «Интервальная съемка», «Несколько позиций сцены» и «Несколько длин волн».

Выберите вкладку «Сохранение», чтобы указать место, где должен быть сохранен эксперимент. Затем выберите вкладку «Таймлапс», чтобы ввести количество временных точек, продолжительность и временной интервал. Выберите вкладку «Этап». Включите яркое поле и определите положение ооцитов, открыв новое окно и выбрав «Получить», «Получить» и «Показать в реальном времени».

Как только ооциты будут найдены, переключитесь обратно в «Окно многомерного сбора» и нажмите «+», чтобы установить местоположение ооцитов. Выберите вкладку «Длины волн» и установите три разные длины волн для brightfield, YFP и mCherry. Отрегулируйте экспозицию для Ypet и mCherry. Затем начните эксперимент с покадровой съемкой, нажав «Получить».

Для анализа трансляции Ypet-3' UTR выполните два измерения областей для каждой ооциты. Сам ооцит обтравливается по «Области эллипса», а небольшая область вокруг ооцита используется для вычитания фона, нажимая на «Прямоугольная область». Экспортируйте данные измерений региона в таблицу, нажав «Открыть журнал», а затем «Данные журнала».

Для каждого отдельного ооцита и для всех измеренных временных точек вычтите измерение области фона из измерения области области ооцита отдельно для длин волн YFP и mCherry.