Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:01 мин. • July 8th, 2025
Слезная пленка - защитная жидкость, покрывающая глаз - помогает смазывать и поддерживать эпителиальные клетки роговицы глаза, CEC, в здоровом, метаболически активном состоянии. Поврежденная слезная пленка, как при болезни сухого глаза, может вызвать испарение слезы из ЦЭК, увеличивая их восприимчивость к инфекции и воспалительным повреждениям.
Составы искусственных слез стабилизируют слезную пленку и улучшают удержание воды, предотвращая обезвоживание клеток.
Для скрининга цитотоксического действия тестовой формы искусственной слезы на CEC с использованием анализа alamarBlue начните с адгезивной культуры CEC человеческого происхождения в подходящих средах. Выбросьте носители.
Инкубируйте культуру клеток с определенной концентрацией препарата искусственной слезы. Слезный состав образует покрытие над клетками. В зависимости от кумулятивного эффекта входящих в состав ингредиентов клетки могут испытывать потерю метаболической активности.
Далее добавьте раствор alamarBlue с содержанием резазурина, слабофлуоресцентного, нетоксичного, водорастворимого красителя синего цвета.
Резазурин диффундирует в клетки и необратимо восстанавливается в метаболически активных клетках преимущественно за счет митохондриальных редуктаз, поскольку он принимает электроны от доноров электронов дыхательно-метаболических процессов, образуя розовый высокофлуоресцентный резоруфин, который свободно перемещается из клеток в раствор. Переложите раствор, содержащий резоруфин, в свежий многолуночный планшет.
С помощью считывателя флуоресцентных пластин измерьте интенсивность флуоресценции. Низкое значение интенсивности флуоресценции указывает на низкую клеточную метаболическую активность, что указывает на нежелательное воздействие слезного состава на ЦЭК.
Извлеките питательные среды из лунок и немедленно обработайте клетки 150 микролитрами исследуемой формулы или раствором для контроля среды. Затем инкубируйте клетки в течение 30 минут.
Удалите испытуемый раствор из клеток, и добавьте 0,5 миллилитра 10% раствора метаболического красителя. Инкубируйте клетки еще четыре часа.
После инкубации извлеките по 100 микролитров раствора красителя из каждой лунки и переложите его в 96-луночный планшет. Используйте планшетный ридер для измерения флуоресценции каждой лунки, установив возбуждение на 540 нанометров и излучение на 590 нанометров.