Анализ мониторинга подкисления кишечника: методика изучения подкисления просвета кишечника у дрозофил с использованием бромфенолового синего красителя

Средняя кишка насекомого содержит область медных клеток - CCR, которая отвечает за закисление кишечника. В этой области находятся специализированные секреторные клетки – медные клетки, которые вырабатывают кислоту, которая проходит через узкий канал, образованный соседними интерстициальными клетками. Кислота выделяется в просвет кишечника, способствуя пищеварению.

Чтобы контролировать закисление кишечника у дрозофил, принимайте взрослых мух, голодающих в течение достаточного времени. Поместите мух в тарелку Петри, содержащую одну каплю корма для мух с добавлением бромфенолового синего или BPB - pH-чувствительного индикаторного красителя. Позвольте голодным мухам добывать пищу в течение определенного периода времени.

После приема пищи кислота, вырабатываемая медными клетками, достигает просвета кишечника и смешивается с пищей, содержащей BPB. При кислом pH молекулы BPB протонируются, что меняет их цвет с синего на желтый, что указывает на закисление.

По завершении эксперимента поместите пластину Петри на лед. Низкая температура прекращает нервно-мышечную активность у мух и обезболивает их. Поместите отдельную муху под стереомикроскоп и хирургическим путем изолируйте неповрежденный пищеварительный тракт.

Изучите цвет CCR, чтобы определить уровень закисления кишечника. Желтая окраска указывает на закисление, а синяя – на отсутствие закисления.

Осмотрите пищеварительный тракт всех мух и рассчитайте процент особей с закислением кишечника.

Начните подготовку к анализу на закисление кишечника с приготовления корма для мух с помощью рН-чувствительного бромфенолового синего или красителя BPB. Для этого растопите корм от мух в микроволновой печи и дайте ему остыть до теплого состояния. Добавьте 1 миллилитр 4% BPB в 1 миллилитр теплой пищи с помощью лунки для перемешивания. С помощью пипетки добавьте корм от мух, содержащий BPB, в одну точку объемом примерно 200 микролитров в центре чашки Петри.

Затем соберите мух Drosophila melanogaster в возрасте от 0 до 2 дней и дайте им восстановиться на стандартном корме из кукурузной муки. Перед экспериментом уморите мух голодом в течение 24 часов при комнатной температуре во флаконе, содержащем салфетку для лабораторной салфетки, смоченную примерно 2 миллилитрами деионизированной воды.

Пересадите голодных мух в чашку Петри, содержащую отдельные точки свежеприготовленного корма для мух с добавлением 2% BPB, чтобы позволить мухам питаться в течение четырех часов при комнатной температуре, находясь под воздействием света.

Через четыре часа соберите мух. Затем приступайте к хирургической изоляции кишок обезболенных мух в 1x PBS с помощью щипцов под стереомикроскопом. Подсчитайте количество мух, у которых наблюдается сильное окрашивание BPB в кишечнике, и рассчитайте процентное соотношение, используя уравнение.