Анализ флуоресцентной утечки для изучения взаимодействия проникающего пептида с мембраной

Проникающие в клетки пептиды, CPP, короткие, положительно заряженные пептиды, могут взаимодействовать с клеточными мембранами и пересекать их, облегчая доставку непроницаемых для клеток грузов.

Для изучения мембранного проникабилизационного потенциала тестируемого ХТБ in vitro с использованием имитации клеточной мембраны начинают с крупного униламеллярного везикулы, LUV, суспензии.

LUV содержат фосфолипидный бислой, загруженный непроницаемым для мембраны флуоресцентным зондом и соответствующей парой гасителей. В везикулах гаситель взаимодействует с флуоресцентным зондом из-за их непосредственной близости, вызывая гашение флуоресценции.

Пипетируйте суспензию LUV в кварцевую флуоресцентную кювету и разбавьте с помощью буфера. Добавьте магнитную полосу. Перенесите на спектрофлуориметр с магнитным перемешиванием для предотвращения осаждения LUV во время работы. Определите фоновую флуоресценцию, чтобы исключить любые утечки LUV.

Добавляйте желаемую концентрацию CPP в суспензию LUV через равные промежутки времени.

Основываясь на гидрофобности и заряде аминокислотных остатков CPP, они возмущают липидную мембрану LUV, что приводит к проникновению в мембрану и пермеабилизации.

Повреждение мембраны везикулы приводит к утечке флуоресцентного зонда и гасителя в окружающий раствор, увеличивая их пространственное разделение. В результате зонд проявляет флуоресценцию.

Дальнейшее добавление раствора CPP приводит к увеличению пермеабилизации LUV и интенсивности флуоресценции. Увеличение интенсивности флуоресценции при добавлении CPP свидетельствует о проникающем потенциале мембраны пептида.

Чтобы измерить утечку флуоресценции, разведите LUV в 1 миллилитре HEPES Buffer 2 в кварцевой флуоресцентной кювете до конечной концентрации 100 микромолей и добавьте магнитную мешалку для облегчения гомогенизации раствора во время эксперимента.

Измеряйте только LUV в течение первых 100 секунд для оценки фоновой флуоресценции, прежде чем измерять утечку как увеличение интенсивности флуоресценции при добавлении аликвот пептидного раствора в течение следующих 900 секунд.

Чтобы измерить 100% утечку флуоресценции в качестве положительного контроля, добавьте 1 микролитр Triton X-100 в LUV для растворения везикул, что приведет к полному негаслению зонда в течение последних 100 секунд анализа. Затем используйте формулу для расчета процента утечки в каждый момент времени.