Анализ растворимых белков для количественного определения содержания растворимого белка в тканях растений

Чтобы количественно определить содержание растворимого белка в растительной ткани в пробирке, начните с соответствующего количества измельченной, лиофилизированной растительной ткани.

Добавьте в тюбик гидроксид натрия, щелочь, и обработайте ультразвуком. Щелочная среда под воздействием механических сил разрушает клетки, высвобождая внутриклеточное содержимое, в том числе макромолекулы – растворимые белки и углеводы. Инкубируйте при более высоких температурах.

В присутствии тепла щелочь вызывает гидролиз белка, образуя более мелкие пептиды и увеличивая растворимость белка. Кроме того, углеводы расщепляются.

Центрифугируйте смесь. Соберите солюбилизированный белоксодержащий надосадочный жидкость. Добавьте соляную кислоту для нейтрализации pH.

Обработайте пробу трихлоруксусной кислотой, ТСА. ТСА разрушает гидратационную оболочку, окружающую белки, что приводит к агрегации белков и выпадению в осадок.

Центрифугируйте и удалите ТСА-содержащую надосадочную жидкость. Промойте протеиновую гранулу ледяным ацетоном, чтобы удалить остатки ТСА, которые могут повлиять на оценку растворимого белка.

Высушите ацетон на воздухе. Ресуспендируйте белковую гранулу в гидроксиде натрия. Разбавить деионизированной водой. Переложите в лунки многолуночную пластину.

Добавьте кислотный раствор красителя Coomassie Brilliant Blue G-250. В кислых условиях краситель связывается с остатками основных аминокислот в солюбилизированных белках, в результате чего образуется синий комплекс белок-краситель.

С помощью спектрофотометра измеряют абсорбцию комплекса белок-краситель, пропорциональную содержанию растворимого белка в растительной ткани.

Для начала взвесьте повторяющиеся образцы каждой ткани в промаркированные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Далее запишите точную массу каждого образца. С помощью микропипетки добавьте в каждую пробирку 500 микролитров 0,1 молярного гидроксида натрия. Плотно закройте крышки и промакивайте трубки ультразвуком в течение 30 минут.

Далее поместите трубки в предварительно разогретую водяную баню на 15 минут. После этого центрифугируйте пробирки при 15 000 г в течение 10 минут. Пипетируйте надосадочную жидкость в новые пробирки микроцентрифуги с маркировкой с помощью нового наконечника для дозатора для каждого образца.

Добавьте в гранулу 300 микролитров 0,1 моляра гидроксида натрия, и повторите центрифугирование в течение 10 минут. После этого извлеките надосадочную жидкость и перенесите ее в пробирки, содержащие надосадочную жидкость после первого центрифугирования.

Чтобы нейтрализовать pH надосадочной жидкости, добавьте 11 микролитров 5,8 молярной соляной кислоты. Используйте лакмусовую бумагу, чтобы подтвердить, что pH составляет примерно 7.

Далее добавьте в каждую трубочку по 90 микролитров 100% трихлоруксусной кислоты. Затем инкубируйте трубки на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте образцы при 13 000 г в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Осторожно используйте вакуумную линию и стеклянный наконечник микропипетки для удаления трихлоруксусной кислоты.

Будьте очень осторожны, чтобы не потревожить гранулу с помощью всасывающего наконечника.

Далее промойте гранулу 100 микролитрами ацетона, охлажденного до минус 20 градусов по Цельсию. Затем дайте ацетону испариться в вытяжном шкафу. Растворите белковую гранулу с 1 миллилитром гидроксида натрия. Могут потребоваться дополнительные раунды нагрева, вортекса и ультразвуковой обработки.

Добавьте по 160 микролитров каждого стандартного раствора IgG в 96-луночный планшет в трех экземплярах, начиная с позиции А1. Далее в новую 1,5-миллилитровую пробирку добавьте по 50 микролитров раствора каждого образца в 950 микролитров дистиллированной воды. Затем добавьте по 60 микролитров каждого разведенного образца в луночный планшет в трех экземплярах, начиная с положения H1. Добавьте 100 микролитров дистиллированной воды во все пустые и неизвестные лунки для проб.

С помощью многоканальной пипетки добавьте 40 микролитров белкового красителя Coomassie brilliant blue G-250 в каждую лунку пластины. С помощью иглы лопайте все пузырьки, присутствующие в лунках. После этого дайте тарелке понервироваться при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем с помощью микропланшетного спектрофотометра запишите значения поглощения для каждой лунки на 595 нанометрах.