Анализ роста на основе люциферазы для количественной оценки внутриклеточного размножения паразитов

Toxoplasma gondii - одноклеточный простейший - это облигатный анаэробный паразит, размножающийся только внутри клеток хозяина.

Чтобы количественно оценить внутриклеточный рост паразита с помощью анализа на основе люциферазы, возьмите суспензию клеток паразита, экспрессирующих люциферазу - фермент, который производит люминесценцию при реакции со своим субстратом. Добавьте суспензию в культуру фибробластов крайней плоти человека и инкубируйте в течение достаточного времени.

Паразит связывается с рецепторами клетки-хозяина и интернализуется через эндоцитарный процесс, образуя паразитофорную вакуоль. Структура обеспечивает нишу для размножения паразита.

После заражения аспирируйте среду, удаляя неинтернализованных паразитов. Добавьте буфер для лизиса, содержащий моющее средство и люциферин – субстрат для люциферазы. Детергент в буфере создает поры в клеточной мембране и полностью лизирует клетки, в результате чего происходит высвобождение люциферазы.

Высвобождаемый фермент окисляет молекулы люциферина, излучая свет. Измерьте интенсивность люминесценции для определения активности люциферазы. Используя реплицируемые лунки, содержащие инфицированные клетки-хозяева, измерьте активность люциферазы через заранее определенные промежутки времени после заражения.

Построить график зависимости нормированной интенсивности люминесценции от временных интервалов, чтобы получить кратные изменения в росте паразитов с течением времени. Временное повышение интенсивности свидетельствует об успешном размножении паразита.

Постройте значения в логарифмической шкале, чтобы рассчитать наклон кривой, представляющий время удвоения паразита.

Чтобы провести анализ роста токсоплазмы на основе люциферазы, начните с осторожной аспирации среды из предварительно засеянных 96-луночных микропланшетных культур фибробластов крайней плоти человека и инокулируйте 150 микролитров суспензии без паразитов в лунки в трехколоночном, пятирядном формате.

После четырехчасовой инкубации в инкубаторе для клеточных культур тщательно отсасывайте среду из каждой лунки, чтобы удалить неинвазированных паразитов, и заполните лунки в каждом, кроме первого ряда, средой без фенола и красных при комнатной температуре. Затем добавьте 100 микролитров 12,5 микромольного раствора субстрата люциферазы в PBS в каждую лунку верхнего ряда и инкубируйте микропланшеты в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить полный лизис клеток.

В конце инкубации измерьте активность люциферазы на считывателе микропланшетов. Каждое показание представляет собой начальное количество инвазированных паразитов через четыре часа после заражения. Повторяйте анализ каждые 24 часа в течение следующих четырех дней, не меняя среду.

Чтобы рассчитать нормализованное изменение роста паразита в несколько раз, каждое показание может быть разделено на начальное показание через четыре часа после заражения. Затем log2 нормализованного кратного изменения роста паразитов может быть построен на графике для каждой временной точки и подвергнут функции линейной регрессии для получения наклона, который представляет время удвоения.