Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 4:14 мин. • July 8th, 2025
Msp1, АТФаза в митохондриальной наружной мембране, удаляет неправильно локализованные белки, закрепленные хвостом, или TA, из мембраны через ее гексамерную центральную пору, способствуя их деградации.
Чтобы понять механизм транслокации, со-реконструируйте белки TA и Msp1 в липосомы, обеспечивая их интеграцию в липидный бислой.
Приготовьте реакционную смесь, добавив восстановленные липосомы в подходящий буфер, содержащий шапероны — цитозольные белки контроля качества. Шапероны помечены глутатион-S-трансферазой или ферментом GST.
Добавьте в реакцию аденозинтрифосфат — АТФ. Msp1 связывается с молекулами АТФ и гидролизует их. Используя энергию, генерируемую гидролизом, Msp1 перемещает мембраносвязанные белки TA через свою центральную пору. Шапероны в реакционной смеси связываются с трансмембранным доменом экстрагированных белков ТА.
Затем загрузите реакционную смесь в аффинную очистительную колонну. Колонка содержит смолу, конъюгированную с восстановленным глутатионом или GSH. Белок GST на шаперонах связывается с конъюгированным GSH — его субстратом — прикрепляя белковые комплексы шаперон-ТА к смоле.
Вращайте колонку, чтобы удалить белки ТА, все еще интегрированные в липосомы. Теперь д
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео