Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 5:00 мин. • July 8th, 2025
Моноаминовые нейротрансмиттеры, эндогенные химические посредники, ретранслируют сигналы через синапс, точку контакта между нейронами. Жестко регулируемая система моноаминовых нейротрансмиттеров необходима для нормального функционирования нейронов.
Для скрининга влияния испытуемого препарата на высвобождение моноаминов ex vivo получают срезы ткани мозга крысы, содержащие интересующую область в охлажденном кислородонасыщенном буфере, сохраняя жизнеспособность тканей.
Срезы тканей переносят в лунки многолуночной пластины, с пористыми фильтрующими вставками, подключенными к подаваемой газообразной смеси и содержащей насыщенную кислородом искусственную спинномозговую жидкость, ФХД, дополненную ингибиторами моноаминоксидазы. Инкубировать.
Ингибиторы диффундируют в клетки и инактивируют ферменты моноаминоксидазу, предотвращая деградацию моноаминов и увеличивая их концентрацию, доступную для хранения и высвобождения.
Перенесите тканесодержащие вкладыши в лунки, содержащие оксигенированный КСФ и исследуемый препарат. Инкубировать. Препарат может стимулировать моноаминовую нейротрансмиттерную систему, увеличивая концентрацию моноаминов во вненейрональном пространстве, что приводит к их высвобождению из тканей мозга в раствор.
Высвобождающиеся моноамины проходят через пористые вставки в лунки, отделяясь от тканей.
После инкубации удалите срез ткани, содержащий вкладыши. Соберите раствор моноамина в пробирку, содержащую растворитель, совместимый с высокоэффективной жидкостной хроматографией, ВЭЖХ. Переложите содержимое пробирки в предварительно собранные фильтрующие блоки. Центрифуга, удаляющая основные загрязнения.
Загруженный полученный фильтрат в колонку ВЭЖХ и выполнение хроматографии для определения концентрации моноаминов, свидетельствующей о влиянии исследуемого препарата на высвобождение моноаминов.
Чтобы вызвать высвобождение моноаминов, перенесите образцы тканей в каждую лунку специально изготовленной 48-луночной камеры для оттока, содержащей от 0,5 до 1 миллилитра буфера для оттока на лунку с постоянным, мягким барботированием, и дайте образцам восстановиться в течение 30-50 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
В конце периода равновесия переместите держатель ткани с тканью мозга в лунки, содержащие 500 микролитров насыщенного кислородом буфера оттока с фармакологическим агентом или без него, постукивая держателем по краю лунки, чтобы предотвратить минимальный перенос буфера между лунками, для 20-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации переместите держатель в новый набор лунок, содержащий 500 микролитров буфера для оттока с интересующим препаратом или без него, и верните планшет в инкубатор для клеточных культур еще на 20 минут.
Во время второй инкубации переложите раствор из лунок из первой инкубации в микроцентрифужные пробирки, содержащие 50 микролитров 1 Н хлорной или фосфорной кислоты на льду, и пробирки промаркируйте #1.
В конце второй инкубации переместите держатель ткани в пустые лунки с планшетом на льду, а надосадочную жидкость из второй инкубации перенесите на лед в новые микроцентрифужные пробирки, содержащие 50 микролитров 1 Н хлорной или фосфорной кислоты. Промаркируйте эти пробирки #2.
Когда все надосадочные жидкости будут перенесены, добавьте 1 миллилитр ледяного буфера для рассечения в каждую лунку ткани и используйте маленький пинцет для переноса каждого образца ткани в новую микроцентрифужную пробирку. Удалите буфер из пробирок с образцами и храните ткани при температуре -80 градусов Цельсия. Затем собранные инкубационные растворы перелейте в микроцентрифужные фильтрующие трубки для центрифугирования и поместите фильтрат на лед до проведения анализа ВЭЖХ.