Анализ кальциноза для измерения концентрации кальция в интерстициальных клетках аортального клапана

Створки аортального клапана содержат гетерогенную популяцию интерстициальных клеток клапана, или ВИК, распределенных по слоям внеклеточного матрикса. При стимуляции ВИК трансформируются в остеобласты — клетки, формирующие костный матрикс.

Зрелые остеобласты секретируют коллаген и белки костного матрикса. Эти белки помогают остеобластам прикрепляться к матриксу. Наконец, внутриклеточные ионы кальция попадают в матриксную среду и вместе с фосфатами откладываются в виде минерализованных узелков, что приводит к кальцификации аортального клапана.

Чтобы оценить концентрацию кальция в кальцинированных аортальных клапанах, начните с посева ВИК в шестилуночном планшете. Выбросьте питательную среду, добавьте в лунку остеогенную среду, и инкубируйте.

Во время инкубации инсулин в остеогенной среде стимулирует дифференцировку ВИК в остеогенные фенотипы. Эти остеобласты секретируют белки костного матрикса и аскорбиновую кислоту в остеогенной среде, что побуждает их образовывать богатый коллагеном внеклеточный матрикс.

Наконец, внутриклеточный кальций остеобластов и фосфаты среды образуют минерализованные кристаллы в среде.

Удалите среду, и добавьте раствор соляной кислоты. Инкубируйте для растворения ионов кальция в растворе. Выдавите кислую среду, содержащую кальций, в лунку многолуночного планшета.

Добавьте чувствительный к кальцию краситель и инкубируйте. Молекулы красителя связываются с ионами кальция в кислой среде, образуя краситель и кальциевый комплекс фиолетового цвета.

Измерьте абсорбцию комплекса, которая пропорциональна концентрации кальция в образце.

Перед началом анализа очистите колпак биобезопасности 70% этанолом и нагрейте среду DMEM до 37 градусов Цельсия. Затем высейте 100 000 клеток в 6-луночных планшетах в полном DMEM и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 24 часа замените надосадочную среду на кальцифицирующую, и инкубируйте клетки в течение 7 дней при температуре 37 градусов Цельсия, заменив среду на третий день.

Через 7 дней измерьте концентрацию кальция в 96-луночном планшете с помощью реагента Arsenazo III и зарегистрируйте поглощение на уровне 650 нанометров.