Иммунофлуоресцентный анализ для выявления PM 2,5-опосредованного повреждения ДНК у эмбрионов рыб

У рыбок данио мелкие твердые частицы в окружающей среде, или PM — загрязнитель воздуха — вызывают сердечные сбои, вызванные окислительным стрессом.

Чтобы изучить влияние ТЧ на рыбок данио-рерио, начните с воздействия на эмбрионы рыбок данио-рерио производного извлекаемого из ТЧ органического вещества, ЭОМ, которое запускает генерацию активных форм кислорода, или АФК.

АФК окисляет основание ДНК гуанин до 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина или 8-OHdG и вызывает фосфорилирование гистона H2AX с образованием γH2AX — маркера двухцепочечных разрывов ДНК.

После экспонирования препарируйте сердце рыбки данио и поместите его на предметное стекло. Обработайте сердце фиксирующим раствором, который сшивает белки, стабилизируя клеточную структуру.

Затем добавьте блокирующий реагент для предотвращения неспецифических сайтов связывания. Добавьте первичные антитела, которые нацелены на γH2AX и 8-OHdG в сердечных клетках.

Затем добавьте два флуоресцентно меченных вторичных антитела разного цвета, которые специфически связываются с Fc-областью соответствующего первичного антитела. Наконец, окрасьте образец DAPI — ДНК-специфичным красителем, который связывается с минорной бороздкой богатых AT-богатыми последовательностями в ДНК, образуя флуоресцентный комплекс.

Поместите предметное стекло под флуоресцентный микроскоп, чтобы наблюдать за сигналами экспрессии 8-OHdG и γH2AX в сердцах эмбрионов данио-рерио, обработанных EOM.

Значительно высокая интенсивность флуоресценции от сердечных клеток указывает на вызванное ЭОМ окислительное повреждение ДНК и двухцепочечные разрывы.

С помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте круг на чистом предметном стекле. Добавьте 50 микролитров 4% параформальдегида к 1,25 микролитрам PBS для получения фиксирующего раствора. Затем поместите три рассеченных сердца в один гидрофобный барьерный круг и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.

Сцедите раствор под микроскопом, и высушите образцы при комнатной температуре не менее 5 минут. Вымойте слайды три раза в PBST, по 5 минут за одну стирку. Добавьте 50 микролитров БСА к 1000 микролитров ПБСТ для получения 5% раствора БСА и инкубируйте предметные стекла во влажной камере в течение 1 часа, чтобы блокировать связывание неспецифических антител.

Сцедите раствор и промойте образцы три раза PBS в течение 5 минут за промывку. Разведите два микролитра мышиного моноклонального антитела против 8-гидроксидезоксигуанозина и два микролитра кроличьего поликлонального антитела против гамма-H2AX в 296 микролитрах PBST, чтобы получить рабочий первичный раствор коктейля антител.

Инкубируйте образцы сердца с 50 микролитрами первичного раствора коктейля антител во влажной камере в течение не менее 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

Сцедите раствор и промойте образцы три раза PBST в течение 5 минут за промывку. Разведите 1 микролитр меченного FITC козьего вторичного антитела против мышей и 1 микролитр вторичного антитела cy3 козы против кролика в 500 микролитрах PBST для получения рабочего раствора коктейля вторичных антител.

Инкубируйте образцы со вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Сцедите раствор и промойте образцы три раза PBS в течение 5 минут за промывку. Добавьте 20 микролитров DAPI в образцы для ядерного окрашивания, и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре. Нанесите покровный лист на предметное стекло и заклейте его лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и движение.

Визуализируйте образцы под флуоресцентным микроскопом и количественно оцените флуоресцентный сигнал в области сердца с помощью программного обеспечения ImageJ. Рассчитайте относительные изменения, используя среднее значение контрольных выборок ДМСО, и определите статистическую значимость данных.