Анализ агрегации PolyQ для определения нейропротекторного действия соединения у червей

При некоторых нейродегенеративных расстройствах ассоциированный с заболеванием белок содержит расширенный полиглутамин, polyQ, тракт — цепочку последовательных остатков глутамина — и имеет аберрантную конформацию. Нарушенная конформация дестабилизирует белковый гомеостаз, вызывая накопление белка и образование токсических агрегатов, что приводит к дисфункции и гибели нейронов.

Для скрининга защитной способности испытуемого соединения в снижении протеотоксичности, связанной с агрегацией polyQ, получают суспензию трансгенных личинок Caenorhabditis elegans, экспрессирующих флуоресцентно помеченные белки polyQ в мышечных клетках стенки тела.

Возьмите многолуночную пластину, содержащую среду, дополненную бактериальной пищей. Добавьте исследуемый состав в один набор лунок. Переложите личинок в многолуночную пластину. Закройте пластину герметиком, чтобы предотвратить обезвоживание среды и микробное загрязнение. Инкубируют, позволяя личинкам вырасти во взрослых особей.

Во время развития, по мере старения нематоды, белки polyQ постепенно накапливаются в мышечных клетках и образуют агрегаты.

Если тестируемое соединение присутствует в среде, оно проникает в мышечные клетки и, в зависимости от своей защитной способности, может оказывать антиполиQ-агрегационный эффект, подавляя и задерживая полиQ-агрегацию.

Соберите урожай взрослых нематод и центрифугируйте. Повторно суспендируйте гранулированных нематод. Переложите в многолуночный планшет. Обездвижите нематод с помощью азида натрия.

Используя флуоресцентное устройство с высоким разрешением, подсчитайте флуоресцентные точки, представляющие собой полиQ-агрегаты, на нематоду.

Более низкое среднее количество агрегатов polyQ при обработке, чем в контрольных лунках, свидетельствует о более высокой защитной способности испытуемого соединения в снижении протеотоксичности, связанной с агрегацией polyQ.

Начните с переноса от 300 до 500 синхронизированных личинок L1 нематод AM141 в каждую лунку 48-луночного планшета с 500 микролитрами S-среды, содержащей штамм OP50 кишечной палочки, и пятью миллиграммами на миллилитр астрагалана. Запечатайте пластину парапленкой и инкубируйте ее при температуре 20 градусов Цельсия и 120 оборотах в минуту в течение желаемых временных интервалов.

Перенесите нематод в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и трижды промойте буфером M9 центрифугированием, чтобы удалить оставшиеся клетки OP50. Затем ресуспендируйте нематод AM141 в буфере M9.

Теперь перенесите от 10 до 15 нематод в каждую лунку в 384-луночный планшет, установив 10 повторяющихся лунок для каждой обработки, и добавьте 10 микролитров 200 миллимолярного азида натрия в каждую лунку, чтобы парализовать нематод, позволив им осесть на дно.

Поместите пластину в систему визуализации с высоким содержанием жидкости для получения флуоресцентных изображений. Откройте программу для получения изображений и настройте параметры, указанные в рукописи текста. Проанализируйте данные изображения, открыв окно «Просмотреть данные пластины» и выбрав «Тестовую пластину» для анализа изображения.

Дважды щелкните по тестовой лунке, чтобы отобразить ее изображение. Затем выберите «Подсчет ядер» в качестве метода анализа и нажмите на кнопку «Настроить параметры». Определите исходное изображение из канала FITC и выберите «Стандартный алгоритм».

Установите параметры анализа изображений, как описано в текстовой рукописи, и протестируйте их для оптимизации метода анализа. Сохраните настройки и запустите анализ по всем скважинам. Экспортируйте «Общее количество ядер» как общее количество агрегатов Q40::YFP в каждой скважине.

Подсчитайте количество нематод в каждой скважине и рассчитайте среднее количество агрегатов Q40::YFP на нематоду в каждой группе. Затем рассчитайте индекс торможения.