Почему для проверки конъюгации антитела и антигена используется метод ELISA?

Метод ELISA подтверждает успешное конъюгирование путем обнаружения образования комплексов антитело-антиген-антитело посредством колориметрической реакции. Это обеспечивает количественный специфический результат, позволяющий отличить конъюгированные формы от неконъюгированных. Данный метод позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего использования конъюгата в процессе его разработки, подтверждая доступность эпитопа после связывания.

Как блокирующий раствор повышает точность ИФА при верификации конъюгации?

Блокировка предотвращает неспецифическое связывание конъюгатов антитело-антиген с поверхностью планшета для ИФА, снижая фоновый сигнал. Это гарантирует, что регистрируемый сигнал отражает только специфическое связывание между захватывающим антителом и эпитопом антигена. Повышение специфичности увеличивает достоверность количественной оценки эффективности конъюгации.

Что измеряет спектрофотометрический анализ в данном протоколе ELISA?

Спектрофотометрия позволяет измерить оптическую плотность окрашенного продукта, образующегося в результате фермент-субстратной реакции, которая коррелирует с количеством связавшихся антител, конъюгированных с ферментом. Это обеспечивает количественное считывание данных, пропорциональное концентрации конъюгатов антитело-антиген в каждой лунке. Полученные данные позволяют проводить сравнение серий разведений для оценки эффективности конъюгации.

Почему при верификации ELISA используется серийное разведение конъюгатов антитело-антиген?

Последовательное разведение позволяет построить стандартную кривую для количественной оценки эффективности конъюгации в диапазоне концентраций от высокой до низкой. Это позволяет исследователям определить предел обнаружения и оценить чувствительность анализа. Серия разведений обеспечивает интерполяцию концентраций неизвестных образцов и гарантирует, что результаты попадают в динамический диапазон анализа.

Какое именно конъюгированное с ферментом антитело используется для детекции в данном методе ELISA?

Антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, против конъюгата anti-DEC-205/OVA используется для обнаружения первичного антитела, присутствующего в комплексе антиген-антитело. Это фермент-связанное антитело специфически связывается с Fc-фрагментом или идиотипом захваченного антитела в конъюгате. Затем фермент пероксидаза хрена катализирует хромогенную реакцию, обеспечивающую спектрофотометрическое детектирование.

Иммуноферментный анализ для верификации химически связанных конъюгатов антитело-антиген

JoVE Encyclopedia of Experiments

Биологические методы

0 просмотров • 2:57 мин • July 8th, 2025

Чтобы вызвать иммунный ответ, антигены связываются с антителами, специфичными для эндоцитарных рецепторов, присутствующих на поверхности дендритных клеток, или ДК — антигенпрезентирующих клеток, которые помогают в поглощении антигенов.

Образование комплекса антитело-антиген является важным этапом и может быть достигнуто in vitro путем химического связывания антигена с моноклональным антителом, нацеленным на DC.

Чтобы проверить эффективность процесса конъюгации, начните с планшета ИФА, предварительно покрытого захваченными антителами. Обработайте пластину блокирующим раствором, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антигенов с поверхностью покрытия.

Добавьте в планшет химически сшитые конъюгаты антитела-антиген и инкубируйте. Специфический эпитоп антигена взаимодействует с паратопом захваченного антитела, образуя комплекс антитело-антиген-антитело.

Затем наложите на пластину третий набор антител, связанных с ферментом. Эти антитела специфически связываются с первичными антителами, присутствующими в конъюгате, что позволяет его обнаруживать.

Добавьте буфер, содержащий хромогенный субстрат, чтобы визуализировать конъюгаты. Фермент, прикрепленный к антителу, вступает в реакцию с субстратом, образуя окрашенный продукт.

Обработайте пластину подкисленным раствором для инактивации, который инактивирует фермент и завершит реакцию. Проанализируйте пластину спектрофотометрически. Наличие окрашенного раствора вердиктует наличие конъюгатов антитело-антиген и подтверждает успешную конъюгацию.

Чтобы проверить успешность конъюгации методом ИФА, нанесите на соответствующий 96-луночный планшет ИФА 100 микролитров антитела против OVA на лунку и последовательно разбавьте анти-DEC-205/OVA в соотношении 1:2 в блокирующем буфере для получения разведений от 6 микрограммов на миллилитр до 93,8 нанограммов на миллилитр.

Добавьте по 100 микролитров каждого разведения в соответствующие лунки планшета, покрытого антителами, для одночасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте 100 микролитров конъюгированного антитела к пероксидазе хрена против конъюгата анти-DEC-205/OVA в планшет для одночасовой инкубации при комнатной температуре.

Затем добавьте по 50 микролитров субстрата пероксидазы хрена в каждую лунку, чтобы можно было проанализировать цветовую реакцию с помощью спектрофотометрии.