Кометный анализ для выявления повреждений ДНК в клетках

Воздействие вредных агентов вызывает одно- и двухцепочечные разрывы в клеточной ДНК, которые приводят к повреждению ДНК.

Чтобы обнаружить повреждение ДНК, начните с одноклеточной суспензии химически обработанных клеток в сжиженной агарозе с низкой температурой плавления. Загрузите суспензию на предметное стекло и дайте агарозе застыть, что позволит иммобилизовать клетки внутри пористой гелевой матрицы.

Обработайте клетки лизисным буфером. Детергенты в буфере растворяют клеточные и ядерные мембраны, в то время как соли удаляют гистоны из ДНК, образуя нуклеоидное тельце, содержащее ДНК, прикрепленную к ядерной матрице.

Инкубируйте предметные стекла в щелочном буфере для электрофореза. Это заставляет ДНК раскручиваться и генерировать одноцепочечные фрагменты. Поместите предметное стекло в аппарат для электрофореза, и подключите его к источнику питания. Это позволяет мигрировать отрицательно заряженной ДНК к положительному аноду.

Неповрежденная ДНК остается ограниченной в нуклеоидном теле. Напротив, более мелкие, поврежденные фрагменты ДНК начинают двигаться к аноду. Это дифференциальное движение образует кометоподобную структуру, в которой неповрежденная ДНК образует голову, а поврежденная ДНК формирует хвост кометы.

Инкубируйте предметное стекло в нейтрализационном буфере, чтобы одноцепочечные фрагменты ДНК могли восстановиться. Далее обработайте предметное стекло флуоресцентным красителем, который окрашивает ДНК. Визуализируйте предметное стекло под флуоресцентным микроскопом.

Интенсивность и длина хвоста коррелируют со степенью повреждения клеточной ДНК.

Для начала приготовьте агарозу с низкой температурой плавления 0,6% в PBS и поместите ее на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Пометьте матовый конец предварительно покрытых слайдов именем, датой и информацией о лечении с помощью перманентного маркера или карандаша.

Поставьте охлаждающую пластину на плоский стол и вставьте два замороженных охлаждающих пакета в выдвижной ящик под металлической поверхностью. Затем поместите предметные стекла на охлаждающую пластину для предварительного охлаждения в течение 1-2 минут. Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость из пробирок с образцами, и немедленно поместите их обратно на лед. Повторно суспендируйте клеточную гранулу с 200 микролитрами 0,6% агарозы с низкой температурой плавления и перемешайте пипеткой.

Далее добавьте 80 микролитров клеток, содержащих агарозу, на охлажденное предметное стекло и быстро наложите на гель покровную крышку. Дайте гелю застыть на охлаждающей пластине в течение 1-2 минут. Тем временем приготовьте 500 миллилитров рабочего раствора лизисного буфера, и вылейте его в чашку для лизиса.

После того, как гели застынут, быстро снимите покровные стекла, осторожно удерживая предметное стекло между большим и указательным пальцами, и сдвинув покровное стекло с геля. Затем поместите слайды внутрь держателя слайдов так, чтобы все черные точки на слайдах были направлены в одном направлении. Поместите держатель предметного стекла внутрь формы для лизиса. Закройте крышку чашки для лизиса, и поставьте ее на инкубацию.

Осторожно снимите держатель предметного стекла с чашки для лизиса, не потревожив гели. Осторожно поместите держатель слайда в форму для мытья посуды, предварительно загруженную ледяной двойной дистиллированной водой. Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду, и оставьте установку на 30 минут.

Поместите замороженный охлаждающий пакет под резервуар для электрофореза для поддержания оптимальной температуры буфера. Затем добавьте в бак рабочий раствор ледяного электрофореза и переложите в него держатель затвора. Расположите предметные стекла так, чтобы клетка, содержащая гели, была направлена к катоду.

Инкубируйте предметные стекла в резервуаре для электрофореза в течение 20 минут, чтобы ДНК раскрутилась. Затем включите блок питания, чтобы выполнить электрофорез на 20 минут при напряжении 1,19 вольт на сантиметр. После завершения электрофореза выключите электропитание и снимите держатель предмета с бака для электрофореза. Дайте держателю предметного стекла стечь на папиросной бумаге в течение 30 секунд.

Затем поместите держатель предметного стекла в чашку с буфером нейтрализации и оставьте на 20 минут. После этого поместите его в посуду для мытья белья, содержащую ледяную воду двойной дистилляции, и оставьте на 20 минут. После мытья извлеките держатель слайда из воды, и дайте предметным стеклам высохнуть в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа.

Чтобы увлажнить предметные стекла, переложите держатель предметных стекол в миску с ледяной водой двойной дистилляции и оставьте на 30 минут. Затем поместите держатель предметного стекла в чашку для окрашивания, содержащую 2,5 микрограмма на миллилитр раствора йодида пропидия.

Закройте посуду для окрашивания крышкой, и выдержите ее 20 минут в темноте при комнатной температуре. После инкубации переложите задвижку в отдельную посуду, и промойте ее ледяной водой двойной дистилляции в течение 20 минут.

Снимите держатель предметного стекла с чашки и полностью высушите его в темноте, либо в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, либо при комнатной температуре. После полного высыхания слайдов храните их в коробке слайдов в темноте до тех пор, пока они не будут готовы к анализу изображений.