Анализ поглощения радиоактивных аминокислот для количественной оценки клеточного поглощения аминокислот

Транспортеры аминокислот представляют собой мембраносвязанные белки, которые опосредуют перенос аминокислот через клеточные мембраны, регулируя жизненно важные клеточные процессы.

Для изучения поглощения аминокислот in vitro берут культуру стромальных клеток, полученных из костного мозга мыши. Отсасывайте питательную среду. Добавьте предварительно подогретый буфер с добавлением глутамина — аминокислоты, меченной радиоактивным водородом. Инкубируйте в течение необходимого времени.

Предварительно нагретый буфер обеспечивает физиологическую температуру и соответствующий рН, необходимые для поглощения глютамина клетками. Транспортеры глутамина состоят из транспортных доменов, отвечающих за транслокацию субстрата через котранспорт с ионами натрия, и мембранно-закрепленных доменов каркаса.

Транспортный домен связывается с меченым глутамином вместе с ионами натрия из буфера. После связывания он высвобождает молекулы в цитоплазму. Одновременно транспортный домен перемещает внутриклеточные ионы натрия и нейтральные аминокислоты за пределы клетки, что приводит к клеточному гомеостазу.

Промойте клетки ледяным буфером, завершив реакцию и удалив весь внеклеточный глутамин, меченный радиоактивными метками. Добавьте раствор моющего средства. Детергент лизирует клетки, вызывая высвобождение внутриклеточного глутамина, меченного радиоактивными метками.

Центрифугируйте лизат. Добавьте содержащую глютамин надосадочную жидкость во флакон со сцинтилляционным коктейлем и поместите флакон внутрь сцинтилляционного счетчика.

Молекулы глютамина, меченные радиоактивными веществами, испускают высокоэнергетические бета-частицы. Сцинтилляторы в коктейле поглощают частицы и излучают световые импульсы, которые обнаруживаются сцинтилляционным счетчиком.

Измерьте радиоактивность, чтобы оценить поглощение глютамина клетками.

Чтобы начать анализ поглощения аминокислот, в каждую лунку 12-луночного тканевого культурального планшета в среде альфа-МЭМ добавляют FBS, пенициллин и стрептомицин в 10 по 10 клеток. Наложите дополнительные лунки клеток для количественного определения количества клеток для каждого условия нормализации.

Затем инкубируйте клетки в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение двух-трёх дней до слияния. После инкубации аспирируйте среду, и дважды промойте клетки одним миллилитром PBS при pH 7,4. Затем аспирируйте PBS перед промыванием клеток один раз одним миллилитром Krebs Ringers HEPES, или KRH.

Инкубируйте клетки с 0,5 миллилитрами свежеприготовленного KRH, содержащего четыре микрокюри на миллилитр рабочей среды L-[^3,4-3H]-глютамина в течение пяти минут. После инкубации соберите радиоактивную среду для дозирования в контейнер для жидких отходов. Затем трижды промойте клетки ледяным KRH, чтобы завершить реакцию.

Затем добавьте по одному миллилитру 1% додецилсульфата натрия в каждую лунку и растирайте смесь 10 раз, чтобы лизировать и гомогенизировать клетки. Затем перенесите лизаты клеток в пробирку объемом 1,5 миллилитра и осветлите лизат путем центрифугирования с минимальной скоростью 10 000 г в течение 10 минут.

Перенесите надосадочную жидкость в сцинтилляционный флакон, содержащий восемь миллилитров сцинтилляционного раствора, и считайте радиоактивность в отсчетах в минуту с помощью сцинтилляционного счетчика.

Из оставшихся нерадиоактивных пластин клеток трипсинизировать, ресуспендировать и подсчитать клетки, чтобы оценить количество клеток в лизированных радиоактивных культурах. С помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток в одной нерадиоактивной лунке для каждого экспериментального условия.