Why does lactate dehydrogenase dependence matter for target validation?

The assay relies on exogenous lactate dehydrogenase to convert lactate to pyruvate, ensuring that signal generation is not confounded by endogenous enzymes in the lysate. This dependence allows specific attribution of colorimetric signal to lactate concentration, supporting accurate target validation in metabolic pathways.

How does isolating lactate as the independent variable fit the discovery pipeline?

By quantifying lactate levels as a function of experimental conditions, the assay isolates lactate as a measurable output of glycolytic flux, enabling researchers to link genetic or pharmacological perturbations to changes in energy metabolism. This supports early discovery by providing a de-risked, quantitative biomarker of pathway activity.

What do quantitative absorbance measurements at 570 nm enable?

Absorbance readings at 570 nm, after background subtraction, are used to generate a standard curve from known lactate concentrations, allowing interpolation of lactate levels in test samples. This quantitative output enables dose-response analysis and comparison across experimental groups in screening campaigns.

Why do duplicate analysis requirements matter for cross-functional collaboration?

Performing duplicate measurements for each sample increases data reliability and reduces technical variance, which is essential for consistent interpretation across biology, screening, and analytics teams. This practice supports reproducible handoffs between discovery and preclinical units.

What statistical analysis capabilities are required before implementation?

Teams must be able to generate a calibration curve, perform linear regression, and interpolate unknown concentrations from the curve, followed by dilution factor correction (e.g., multiplying by 2.25 as noted in the protocol). These capabilities ensure accurate lactate quantification from raw absorbance data.

Колориметрический анализ для количественного определения лактата в исследуемых образцах

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 3:08 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В живых клетках в анаэробных условиях фермент лактатдегидрогеназа превращает пируват — конечный продукт гликолиза — в лактат — ключевой метаболит. Количество лактата, вырабатываемого в клетках, отражает их метаболический статус.

Чтобы количественно определить внутриклеточную концентрацию лактата, начните с тестового образца безбелкового лизата клеток нематоды. Дополните другие лунки многолуночной пластины раствором лактата различных известных концентраций.

В лизате отсутствуют все белковые ферменты, в том числе эндогенная лактатдегидрогеназа, что обеспечивает точное количественное определение лактата.

Добавьте в каждую лунку буфер для анализа лактата для поддержания соответствующего pH и оптимальной ферментативной активности. Дополните лунки реакционной смесью, содержащей фермент лактатдегидрогеназу, никотинамид-адениндинуклеотид — НАД — кофермент, а также колориметрический зонд и инкубируйте.

Во время инкубации лактатдегидрогеназа катализирует окисление клеточного лактата до пирувата с одновременным восстановлением NAD до NADH. Сгенерированный NADH реагирует с колориметрическим зондом с образованием фиолетового продукта.

Спектроскопическое измерение абсорбции фиолетового раствора для испытуемого образца и стандартов лактата на 570 нанометрах. Построение графика значений абсорбции стандартов лактата и построение калибровочной кривой.

Наконец, сравните значение поглощения образца с нормами лактата, чтобы определить количество лактата, присутствующего в исследуемом образце.

Чтобы измерить концентрацию лактата, используйте набор для колориметрического анализа, чтобы провести повторный анализ для исследуемых образцов. Добавьте по 10 микролитров исследуемых образцов в каждую лунку 96-луночного планшета, а затем добавьте буфер для анализа лактата в каждый образец, чтобы довести объем до 50 микролитров.

Разбавьте 100 миллимолярный L(+)-лактат стандарта с лактатным буфером до 1 миллимолара. Затем в ряд лунок добавьте 0, 2, 4, 6, 8 и 10 микролитров разбавленного L(+)-лактата стандарта. Добавьте по 50 микролитров реакционной смеси в каждую лунку и выдерживайте при комнатной температуре, защищенной от света, не менее 30 минут, чтобы цвет проявился.

Наконец, используйте считыватель микропланшетов для измерения поглощающей способности каждой лунки на уровне 570 нанометров. Вычтите поглощение фоновой контрольной смеси из поглощения реакционной смеси. Затем постройте стандартную кривую лактата и рассчитайте концентрации лактата по кривой, умножив каждую концентрацию на 2,25.