Почему зависимость от лактатдегидрогеназы имеет значение для валидации мишени?

Метод основан на использовании экзогенной лактатдегидрогеназы для превращения лактата в пируват, что гарантирует отсутствие влияния эндогенных ферментов лизата на генерацию сигнала. Такая зависимость позволяет однозначно связать колориметрический сигнал с концентрацией лактата, что обеспечивает точную валидацию мишеней в метаболических путях.

Как выделение лактата в качестве независимой переменной вписывается в процесс поиска новых открытий?

Путем количественного определения уровней лактата в зависимости от экспериментальных условий данный анализ выделяет лактат в качестве измеряемого показателя гликолитического потока, что позволяет исследователям связать генетические или фармакологические воздействия с изменениями в энергетическом обмене. Это способствует ускорению ранних этапов поиска путем предоставления надежного количественного биомаркера активности метаболического пути.

Что позволяют определить количественные измерения абсорбции при 570 nm?

Значения абсорбции при 570 nm после вычитания фона используются для построения стандартной кривой по известным концентрациям лактата, что позволяет интерполировать уровни лактата в исследуемых образцах. Такие количественные данные позволяют проводить анализ «доза-эффект» и сравнивать экспериментальные группы в рамках скрининговых кампаний.

Почему требования к дублирующему анализу имеют значение для кросс-функционального взаимодействия?

Выполнение повторных измерений для каждого образца повышает достоверность данных и снижает техническую вариативность, что крайне важно для согласованной интерпретации результатов группами по биологии, скринингу и аналитике. Такая практика обеспечивает воспроизводимость при передаче данных между подразделениями по поиску новых соединений и доклинических исследований.

Какими навыками статистического анализа необходимо обладать перед внедрением?

Команды должны уметь строить калибровочную кривую, проводить линейную регрессию и интерполировать неизвестные концентрации по этой кривой с последующей коррекцией на коэффициент разведения (например, умножением на 2,25, как указано в протоколе). Эти навыки обеспечивают точное количественное определение лактата на основе исходных данных абсорбции.

Колориметрический анализ для количественного определения лактата в исследуемых образцах

JoVE Encyclopedia of Experiments

Биологические методы

0 просмотров • 3:08 мин • July 8th, 2025

В живых клетках в анаэробных условиях фермент лактатдегидрогеназа превращает пируват — конечный продукт гликолиза — в лактат — ключевой метаболит. Количество лактата, вырабатываемого в клетках, отражает их метаболический статус.

Чтобы количественно определить внутриклеточную концентрацию лактата, начните с тестового образца безбелкового лизата клеток нематоды. Дополните другие лунки многолуночной пластины раствором лактата различных известных концентраций.

В лизате отсутствуют все белковые ферменты, в том числе эндогенная лактатдегидрогеназа, что обеспечивает точное количественное определение лактата.

Добавьте в каждую лунку буфер для анализа лактата для поддержания соответствующего pH и оптимальной ферментативной активности. Дополните лунки реакционной смесью, содержащей фермент лактатдегидрогеназу, никотинамид-адениндинуклеотид — НАД — кофермент, а также колориметрический зонд и инкубируйте.

Во время инкубации лактатдегидрогеназа катализирует окисление клеточного лактата до пирувата с одновременным восстановлением NAD до NADH. Сгенерированный NADH реагирует с колориметрическим зондом с образованием фиолетового продукта.

Спектроскопическое измерение абсорбции фиолетового раствора для испытуемого образца и стандартов лактата на 570 нанометрах. Построение графика значений абсорбции стандартов лактата и построение калибровочной кривой.

Наконец, сравните значение поглощения образца с нормами лактата, чтобы определить количество лактата, присутствующего в исследуемом образце.

Чтобы измерить концентрацию лактата, используйте набор для колориметрического анализа, чтобы провести повторный анализ для исследуемых образцов. Добавьте по 10 микролитров исследуемых образцов в каждую лунку 96-луночного планшета, а затем добавьте буфер для анализа лактата в каждый образец, чтобы довести объем до 50 микролитров.

Разбавьте 100 миллимолярный L(+)-лактат стандарта с лактатным буфером до 1 миллимолара. Затем в ряд лунок добавьте 0, 2, 4, 6, 8 и 10 микролитров разбавленного L(+)-лактата стандарта. Добавьте по 50 микролитров реакционной смеси в каждую лунку и выдерживайте при комнатной температуре, защищенной от света, не менее 30 минут, чтобы цвет проявился.

Наконец, используйте считыватель микропланшетов для измерения поглощающей способности каждой лунки на уровне 570 нанометров. Вычтите поглощение фоновой контрольной смеси из поглощения реакционной смеси. Затем постройте стандартную кривую лактата и рассчитайте концентрации лактата по кривой, умножив каждую концентрацию на 2,25.