Колориметрический анализ для количественного определения лактата в исследуемых образцах

В живых клетках в анаэробных условиях фермент лактатдегидрогеназа превращает пируват — конечный продукт гликолиза — в лактат — ключевой метаболит. Количество лактата, вырабатываемого в клетках, отражает их метаболический статус.

Чтобы количественно определить внутриклеточную концентрацию лактата, начните с тестового образца безбелкового лизата клеток нематоды. Дополните другие лунки многолуночной пластины раствором лактата различных известных концентраций.

В лизате отсутствуют все белковые ферменты, в том числе эндогенная лактатдегидрогеназа, что обеспечивает точное количественное определение лактата.

Добавьте в каждую лунку буфер для анализа лактата для поддержания соответствующего pH и оптимальной ферментативной активности. Дополните лунки реакционной смесью, содержащей фермент лактатдегидрогеназу, никотинамид-адениндинуклеотид — НАД — кофермент, а также колориметрический зонд и инкубируйте.

Во время инкубации лактатдегидрогеназа катализирует окисление клеточного лактата до пирувата с одновременным восстановлением NAD до NADH. Сгенерированный NADH реагирует с колориметрическим зондом с образованием фиолетового продукта.

Спектроскопическое измерение абсорбции фиолетового раствора