JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 2:29 мин • July 8th, 2025
Клеточные уровни пирувата — ключевого промежуточного продукта в биохимических путях, производящих энергию — могут быть оценены с помощью колориметрических анализов на основе ферментов.
Для определения уровня пирувата в клетках Caenorhabditis elegans — непаразитической нематоды — берут клеточную фракцию, приготовленную из взрослых червей, содержащую пируват. Обработайте раствором, удалив клеточные белки, и соберите осветленную клеточную фракцию — исследуемый образец — содержащую пируват. Отсутствие клеточных белков обеспечивает точное определение уровня пирувата.
Начните с добавления рабочего реагента, содержащего ферменты пируватоксидазу и пероксидазу хрена, а также хромогенный краситель. Выдержите смесь в темноте в течение достаточного времени.
Во время инкубации пируватоксидаза вступает в реакцию с пируватом — его субстратом — образуя перекись водорода в качестве побочного продукта. Отсутствие света препятствует самопроизвольному разложению перекиси водорода.
Пероксидаза хрена катализирует реакцию между перекисью водорода и хромогенным красителем, образуя окрашенный продукт. Интенсивность окрашенного продукта реакции прямо пропорциональна концентрации пирувата в образце.
По завершении инкубационного периода поместите образец внутрь планшетного ридера и измерьте абсорбцию. Сгенерируйте стандартную кривую с помощью последовательного разведения с известными концентрациями пируватов.
Нанесите измеренное значение поглощения испытуемого образца на кривую для определения концентрации пирувата в испытуемом образце.
Используйте набор для колориметрического анализа для измерения концентрации пирувата в исследуемых образцах, а также проведите дуплексные исследования.
Добавьте 10 микролитров исследуемых образцов в разные лунки 96-луночного планшета, и добавьте в каждый образец по 90 микролитров рабочего реагента. Выдерживать под крышкой в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем поместите планшет в считыватель микропланшетов, чтобы измерить поглощение каждой лунки на 570 нанометров.
Постройте стандартную кривую пирувата и рассчитайте концентрации пирувата по стандартной кривой, умножив каждую концентрацию на 2,25.
В данной статье описывается метод определения клеточного уровня пирувата у Caenorhabditis elegans с помощью колориметрического анализа на основе ферментов. Процесс включает подготовку клеточной фракции, ее обработку для удаления белков и измерение абсорбции для определения концентрации пирувата.
Количественное определение пирувата в клеточных фракциях позволяет проводить точное метаболическое профилирование в доклинических модельных системах. Данный колориметрический анализ помогает группам по раннему поиску лекарственных средств, предоставляя надежные и воспроизводимые данные о метаболических интермедиатах, что позволяет уточнить валидацию мишеней и анализ путей. Точное количественное определение пирувата повышает прогностическую уверенность при модуляции метаболических путей в портфелях трансляционных исследований.
Этот колориметрический метод анализа пирувата интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая как раннюю проверку гипотез, так и последующую валидацию метаболических мишеней.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026