Анализ на пируват для оценки уровня пирувата в клеточных фракциях червей

Клеточные уровни пирувата — ключевого промежуточного продукта в биохимических путях, производящих энергию — могут быть оценены с помощью колориметрических анализов на основе ферментов.

Для определения уровня пирувата в клетках Caenorhabditis elegans — непаразитической нематоды — берут клеточную фракцию, приготовленную из взрослых червей, содержащую пируват. Обработайте раствором, удалив клеточные белки, и соберите осветленную клеточную фракцию — исследуемый образец — содержащую пируват. Отсутствие клеточных белков обеспечивает точное определение уровня пирувата.

Начните с добавления рабочего реагента, содержащего ферменты пируватоксидазу и пероксидазу хрена, а также хромогенный краситель. Выдержите смесь в темноте в течение достаточного времени.

Во время инкубации пируватоксидаза вступает в реакцию с пируватом — его субстратом — образуя перекись водорода в качестве побочного продукта. Отсутствие света препятствует самопроизвольному разложению перекиси водорода.

Пероксидаза хрена катализирует реакцию между перекисью водорода и хромогенным красителем, образуя окрашенный продукт. Интенсивность окрашенного продукта реакции прямо пропорциональна концентрации пирувата в образце.

По завершении инкубационного периода поместите образец внутрь планшетного ридера и измерьте абсорбцию. Сгенерируйте стандартную кривую с помощью последовательного разведения с известными концентрациями пируватов.

Нанесите измеренное значение поглощения испытуемого образца на кривую для определения концентрации пирувата в испытуемом образце.

Используйте набор для колориметрического анализа для измерения концентрации пирувата в исследуемых образцах, а также проведите дуплексные исследования.

Добавьте 10 микролитров исследуемых образцов в разные лунки 96-луночного планшета, и добавьте в каждый образец по 90 микролитров рабочего реагента. Выдерживать под крышкой в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем поместите планшет в считыватель микропланшетов, чтобы измерить поглощение каждой лунки на 570 нанометров.

Постройте стандартную кривую пирувата и рассчитайте концентрации пирувата по стандартной кривой, умножив каждую концентрацию на 2,25.