Спектрофотометрический анализ для определения активности гликогенсинтазы

Гликогенсинтаза ― важнейший фермент в синтезе гликогена ― расщепляет уридиндифосфатную глюкозу, или UDP-глюкозу ― нуклеотидный сахар ― на UDP и гликозильный остаток и добавляет высвобожденный мономер глюкозы к растущей гликогеновой цепи.

Чтобы оценить активность гликогенсинтазы, начните с приема в пробирке реакционной смеси, содержащей гликоген, UDP-глюкозу, АТФ, фосфоенолпируват и никотинамидадениндинуклеотид (NADH). Добавьте нуклеозиддифосфат или NDP, фермент киназу и коктейль ферментов пируваткиназы и лактатдегидрогеназы. Смешайте содержимое и инкубируйте.

Добавьте в пробирку образец, содержащий гликогенсинтазу, чтобы инициировать ферментативную реакцию.

Гликогенсинтаза действует на УДФ-глюкозу, образуя УДФ и гликозильный остаток. Фермент поглощает свободный мономер глюкозы и включает его в гликогеновую цепь реакционной смеси. В присутствии АТФ NDP-киназа реакционной смеси фосфорилирует неиспользованный UDP, превращая его в UTP и генерируя ADP.

Фермент пируваткиназа действует на АДФ и добавляет фосфат, пожертвованный фосфоенолпируватом реакционной смеси, для производства АТФ и пирувата. Затем лактатдегидрогеназа превращает пируват в лактат и окисляет НАДН в ходе реакции.

Измерьте снижение абсорбции НАДН при длине волны 340 нм, чтобы количественно оценить количество потребляемой НАДН, что указывает на успешную активность фермента.

Для начала определения активности гликогенсинтазы разморозьте на льду приготовленные ранее исходные растворы УДФ-глюкозы, АТФ, фосфоенолпирувата и НДФ-киназы. Разогрейте водяную баню до 30 градусов Цельсия.

Когда исходные растворы будут готовы, приготовьте достаточное количество анализной смеси в соответствии с количеством анализов гликогенсинтазы, добавив реагенты в 15-миллилитровую пробирку, как описано в текстовом протоколе.

Приготовьте холостую реакцию, заменив НАДН из реакционной смеси водой, и перенесите реакцию на одноразовую метакрилатную кювету. С помощью пустой реакции установите «Ноль» на спектрофотометре на длине волны 340 нанометров.

Возьмите одну аликвоту 770 микролитров реакционной смеси в пробирке объемом 1,5 миллилитра и последовательно добавьте в пробирку по 2 микролитра смеси NDP-киназы и пируваткиназы/лактатдегидрогеназы.

После тщательного перемешивания инкубируйте пробирку при температуре 30 градусов Цельсия на водяной бане, в течение 3 минут чтобы реакционная смесь предварительно прогрелась. Затем добавьте 30 микролитров образца, содержащего гликогенсинтазу, в 20 миллимолярный трис-буфер при pH 7,8 и осторожно перемешайте перед переносом реакционной смеси в одноразовый метакрилатный кювет.

Поместите кювету в спектрофотометр и зарегистрируйте поглощение на 340 нанометрах с интервалом от 10 до 20 минут. Затем постройте график полученных поглощений в зависимости от времени.