Анализ на основе клеточного импеданса для мониторинга клеточных процессов в режиме реального времени
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:52 мин • July 8th, 2025
Для непрерывного измерения поведения клеток с использованием анализа клеток в реальном времени, RTCA, получают микротитровую пластину RTCA, содержащую матрицы микроэлектродов золота для измерения импеданса, встроенные в дно скважины. Осторожно добавляйте в лунки клеточную культуральную среду.
В электропроводящей среде подайте слабый электрический потенциал на микроэлектроды. Потенциал вызывает протекание электрического тока между микроэлектродами, облегчая измерение базового импеданса — собственного электрического сопротивления среды.
Пипеткой дозируйте нужную концентрацию клеточной суспензии млекопитающих в средысодержащие лунки. Дайте ячейкам равномерно распределиться в лунке.
Во время инкубации клетки прилипают к дну лунки. Адгезивные клетки на микроэлектродах действуют как изолятор, ограничивая протекание тока и увеличивая импеданс.
Постепенно клетки пролиферируют на микроэлектродах, что приводит к увеличению экспоненциального импеданса.
После образования сливающегося клеточного слоя клетки сталкиваются с недостатком питательных веществ и погибают. В результате ячейки отделяются от микроэлектродов, уменьшая импеданс.
Непрерывное измерение импеданса позволяет в режиме реального времени отслеживать клеточные события, включая пролиферацию и гибель клеток.
Чтобы определить подходящее количество клеток для клеточной инфекции, готовьте 24-часовые, примерно 80% конфлюентные клеточные культуры MDCK, как показано, перед промыванием клеток PBS и их сбор с помощью 45-минутной инкубации в 3 миллилитрах 0,25% трипсина-ЭДТА на колбу при 37 градусах Цельсия.
Когда клетки отделятся, остановите реакцию с помощью 7 миллилитров свежей питательной среды на колбу и подсчитайте клетки из каждой культуры. Разбавляют клетки до 4 х 105 клеток на миллилитр среды для культивирования клеток и выполняют двукратное серийное разведение клеток, как показано.
Поместите Е-пластину при комнатной температуре на несколько минут, прежде чем добавить по 100 микролитров среды для клеточных культур в каждую лунку, не касаясь электродов Е-пластины. Разблокируйте опоры и вставьте лицевой конец пластины в карман док-станции прибора для измерения импеданса. Закройте дверцу инкубатора и откройте программное обеспечение.
В разделе "Настройка шаблона эксперимента по умолчанию" выделите выбранные базовые станции и дважды щелкните по главной странице, чтобы ввести название эксперимента. Нажмите «Макет» и введите необходимую информацию о пробе для каждой выбранной лунки пластины. Нажмите «Расписание» | «Шаги» | и «Добавить шаг». Программное обеспечение автоматически добавит 1-секундный шаг для измерения фонового сопротивления.
Нажмите «Выполнить» и «Начать/Продолжить». Нажмите «Plot» и «Add», чтобы выбрать подходящие скважины, подтвердив, что фоновое сопротивление находится в диапазоне от отрицательных 0,1 до 0,1, прежде чем перейти к следующему шагу.
Далее снимите пластину с люльки и добавьте по 100 микролитров каждой клеточной суспензии в соответствующие лунки в двух экземплярах. Оставьте E-пластину в ламинарном проточном колпаке на 30 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по дну лунок, прежде чем загружать E-пластину в карман люльки. Нажмите «Расписание» и «Добавить шаг» и введите значения для мониторинга ячеек каждые 30 минут в течение 200 повторений, прежде чем выбрать «Начать/Продолжить».
Чтобы проверить и построить график данных импеданса ячейки, нажмите «График» и выберите концентрацию клеток, которая находится непосредственно перед стационарной фазой через 24 часа после посева, чтобы получить клетки, которые все еще находятся в фазе роста во время вирусной инфекции.
Обзор
В данной статье описывается метод непрерывного измерения поведения клеток с помощью анализа клеток в режиме реального времени (RTCA). Данный метод основан на мониторинге изменений импеданса в клеточных культурах для оценки пролиферации и гибели клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Анализ клеток в режиме реального времени
- Измерение импеданса
Теоретическое обоснование
- В методе RTCA для измерения импеданса используются микроэлектродные матрицы.
- Адгезия и пролиферация клеток влияют на электрический импеданс.
- Мониторинг импеданса позволяет получить данные о клеточных процессах.
- Открепление клеток коррелирует с дефицитом питательных веществ и гибелью клеток.
Цель исследования
- Разработать метод мониторинга поведения клеток в режиме реального времени.
- Оценить влияние пролиферации и гибели клеток на импеданс.
- Определить оптимальное количество клеток для исследований по инфицированию.
Используемые методы
- Подготовка микротитрационных планшетов RTCA с золотыми микроэлектродами.
- Подача электрического потенциала для измерения базового импеданса.
- Пипетирование суспензий клеток млекопитающих в лунки.
- Непрерывный мониторинг импеданса с течением времени.
Основные результаты
- Повышение импеданса коррелирует с адгезией и пролиферацией клеток.
- Снижение импеданса указывает на открепление и гибель клеток.
- Данные в режиме реального времени позволяют осуществлять мониторинг клеточных событий.
- Можно определить оптимальную концентрацию клеток для инфицирования.
Выводы
- RTCA является эффективным методом мониторинга поведения клеток.
- Измерения импеданса позволяют получить ценные данные о динамике клеток.
- Данный метод может быть применен к различным типам клеток и условиям.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Мониторинг импеданса в реальном времени позволяет проводить непрерывную бесметочную оценку клеточной динамики, предоставляя прогностические данные о пролиферации и цитотоксичности для валидации мишеней на ранних этапах. Данный подход способствует снижению механистических рисков, предоставляя количественные, воспроизводимые данные, которые позволяют принимать решения о целесообразности дальнейших действий (go/no-go) в процессе идентификации ведущих соединений и в рамках доклинических рабочих процессов. Этот метод повышает актуальность портфеля разработок за счет уменьшения биологической неоднозначности в системах, релевантных заболеванию, перед переходом к ресурсоемким последующим приложениям.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством отслеживания в режиме реального времени изменений импеданса клеток, связанных с их пролиферацией и гибелью.
- Операционная ценность: обеспечивает непрерывный мониторинг без использования меток, что снижает вариабельность анализа и способствует согласованной оценке взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: повышает точность прогнозов за счет корреляции профилей импеданса с состоянием клеток, что помогает на ранних этапах снизить биологические риски при выборе мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных, временно-разрешенных данных импеданса, что позволяет проводить стандартизированную оценку влияния соединений на жизнеспособность и рост клеток.
- Практическая ценность: способствует стандартизации и воспроизводимости анализа за счет автоматизированного непрерывного сбора данных в нескольких параллельных лунках.
- Масштабируемость: поддерживает рабочие процессы скрининга со средней пропускной способностью, обеспечивая кинетические показатели в режиме реального времени без необходимости фиксации конечной точки или маркировки.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает плавный переход от стадии открытия к доклинической оценке за счет постоянного безмаркерного мониторинга клеточных ответов.
- Снижение механистических рисков: определение открепления и гибели клеток на основе импеданса позволяет на раннем этапе получить представление о цитотоксических механизмах, что помогает принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков.
- Релевантная заболеванию система: применима к моделям адгезивных клеток млекопитающих, используемым в исследованиях патогенеза гриппа и других вирусных инфекций, что способствует валидации мишеней при инфекционных заболеваниях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Мониторинг импеданса в реальном времени вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинической оценки, обеспечивая кинетическое разрешение клеточных событий, что способствует принятию решений на основе данных на каждом этапе.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов, связывая динамику импеданса с пролиферацией и гибелью клеток в режиме реального времени.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и количественные выходные данные, которые позволяют надежно сравнивать тестовые условия в разные временные точки.
- Аналитика: обеспечивает непрерывные измерения импеданса, позволяя исследователям оценивать клеточные ответы при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают этап ранних открытий с доклинической преемственностью посредством последовательного безмаркерного мониторинга жизнеспособности клеток в системах, релевантных для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемый платформенный ресурс в рамках нескольких проектов, сокращая избыточную разработку анализов и обеспечивая стандартизацию между различными исследовательскими группами.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени, уменьшая механистическую неопределенность за счет безмаркерного мониторинга клеток в режиме реального времени.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость благодаря автоматизированному измерению импеданса в многолуночных форматах.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), повышает эффективность использования капитала и снижает биологические риски на поздних этапах за счет раннего обнаружения цитотоксических или пролиферативных эффектов.
- Влияние на портфель: поддерживает принятие решений по приоритизации и продвижению проектов с учетом рисков, предоставляя количественные непрерывные данные о клеточной динамике.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, проектирования анализов на основе импеданса и интерпретации данных в режиме реального времени.
- Зависимость от специализированного оборудования, включая микротитрационные планшеты с электродами и платформы для измерения импеданса.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов посева клеток, инкубации и сбора данных для обеспечения воспроизводимости результатов.
- При адаптации следует учитывать тип клеток, их адгезивные свойства и совместимость электродов с различными модельными системами.
- Практические ограничения включают чувствительность к неадгезивным клеткам и возможные помехи от проводящих соединений в среде.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы
Похожие видео
0 Просмотры
Impedance основе в режиме реального времени Измерения миграции раковых клеток и вторжения
Похожие видео
0 Просмотры
Обнаружение и захват инвазивных клеточных субпопуляций из кокультур в режиме реального времени
Похожие видео
0 Просмотры
В режиме реального времени Электрические характеристики Сопротивление техника выполнения измерить Вторжение клеточный монослой эндотелиальных раковыми клетками
Похожие видео
0 Просмотры
Трехкамерный анализ импеданса на основе матрицы: метод анализа в реальном времени для оценки инвазивного потенциала раковых клеток путем измерения электрического импеданса
Похожие видео
0 Просмотры
Кинетический анализ выживаемости на основе клеточного импеданса для оценки выживаемости вируса
Похожие видео
0 Просмотры
Импедансные измерения инвазии раковых клеток головного мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Электрический клетки с субстратом Сопротивление зондирования для количественной оценки эндотелиальной пролиферации, барьерную функцию, и Подвижность
Похожие видео
0 Просмотры
Real-Time Сопротивление на основе Cell Analyzer как инструмент, чтобы очертить молекулярных путей, участвующих в нейротоксичности и Нейропротекция в клеточной линии нейронов
Похожие видео
0 Просмотры
Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026