Импедансный клеточный анализ для измерения множественности инфекции вируса гриппа

Во время вирусной инфекции вирус проникает в клетку через эндоцитоз и захватывает клеточный механизм хозяина, производя вирионы потомства. Они высвобождаются, заражая соседние клетки, вызывая каскад инфекций.

Чтобы измерить отношение вируса инфекционного гриппа к клетке в культуре — кратность инфекции — добавьте соответствующую плотность свежеполученной суспензии клеток млекопитающих в микротитровую пластину.

Пластина содержит импедансометрические микроэлектроды золота, встроенные в забой скважины. Инкубируйте, позволяя клеткам прилипнуть к дну лунки и достичь фазы экспоненциального роста до заражения.

Подайте небольшой электрический потенциал между микроэлектродами. Ячейки, прикрепленные к микроэлектродам, действуют как изоляторы, ограничивая протекание тока и увеличивая электрическое сопротивление — импеданс, который измеряется.

Извлеките носитель. Пипеткой заведите в лунки суспензию вируса гриппа. Дополните подходящей сериновой эндопротеазой.

Во время инкубации эндопротеаза серина расщепляет и активирует вирусный гликопротеин гемагглютинин, способствуя его связыванию со специфическими рецепторами клетки-хозяина и последующему проникновению вируса в клетки.

С помощью клеточного механизма-хозяина образуются и высвобождаются новые вирусные частицы, заражающие соседние клетки. В результате инфицированные вирусом клетки претерпевают морфологические изменения и проявляют цитопатические эффекты, что приводит к гибели клеток — клетки отделяются от поверхности микроэлектрода, снижая импеданс с течением времени.

Определите время, необходимое для снижения импеданса до половины начального импеданса перед добавлением вируса. Более короткие временные рамки предполагают более высокую множественность вирусной инфекции.

Чтобы определить корреляцию между значениями CIT₅₀ и кратностью инфекции, после культивирования 3 x 10⁴ свежеразделенных клеток MDCK в каждую стенку электронного микротитровального планшета в течение 24 часов, промойте клетки два раза 100 микролитрами свежей среды для размножения вируса на лунку на промывку и с помощью одноканальной пипетки добавьте 100 микролитров вирусной суспензии в каждую лунку.

Когда все вирусные разведения будут добавлены, аккуратно загрузите пластину в карман подставки прибора при температуре 35 градусов Цельсия и начните контролировать импеданс ячейки каждые 15 минут в течение не менее 100 часов, как показано на рисунке.

После двух циклов измерений нажмите кнопку «Пауза» аппарата и снимите Е-пластину с люльки. Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров среды для размножения вируса, дополненной ТПК-трипсином, и верните пластину с Е-пластиной в карман люльки. Затем приступаем к анализу.