Кинетический анализ выживаемости на основе клеточного импеданса для оценки выживаемости вируса

Вирусы связываются с рецептором клетки-хозяина и интернализуются в эндосому. Эндосомальная мембрана сливается с вирусной мембраной, высвобождая вирусное содержимое внутрь клетки.

Достигнув ядра, вирусный геном транскрибируется в мРНК, а затем транслируется в вирусные белки. Вирусные компоненты попадают в цитоплазму и собираются в вирионы, которые выдавливаются из клетки и вызывают цитопатические эффекты — изменение морфологии клетки-хозяина и гибель.

Чтобы оценить кинетику выживания вируса путем измерения импеданса клетки-хозяина, возьмите многолуночную пластину, покрытую микроэлектродами для измерения импеданса на ее дне. Добавьте в лунки суспензию клеток-хозяев и инкубируйте, чтобы клетки могли прилипнуть к поверхности электрода и расти.

Далее принимают предварительно обработанные солевым раствором вирусные суспензии с разной вирусной нагрузкой. Обработка солевым раствором снабжает вирус хлоридом, который производит хлорноватистую кислоту, которая убивает его, снижая вирусную инфекционность. Добавьте эти вирусные суспензии в соответствующие лунки.

Измерьте клеточный импеданс — явление противодействия протеканию электрического тока через электроды — адгезивными клетками.

Вирусы инфицируют адгезивные клетки-хозяева и изменяют их морфологию, вызывая отслоение трансформированных клеток от электродов. Со временем, по мере того как все больше клеток заражается, клеточный импеданс, опосредованный клеткой-хозяином, уменьшается.

Постройте график клеточного индекса, который представляет собой изменение импеданса из-за отслоения инфицированных клеток, с течением времени.

Чтобы оценить кинетику выживаемости вируса гриппа А, добавьте хлорид натрия до конечной концентрации 35 грамм на литр в дистиллированную воду, и добавьте 900 микролитров полученного физиологического раствора в 2-миллилитровые криопробирки. Добавьте 100 микролитров вирусного запаса в каждую криопробирку и поместите пробирки в инкубатор с температурой 35 градусов Цельсия на соответствующий период экспериментального времени.

За день до окончания инкубации высевайте 3 x 10⁴ свежерасщепленные клетки MDCK в 100 микролитров среды для размножения вируса на лунку, в 16-луночный микротитировальный планшет, и повторяйте шаги, позволяющие измерить фоновое сопротивление и равномерное распределение клеток на дне лунок. Затем выращивайте клетки в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

На следующий день промойте клетки дважды, затем заинфицируйте клетки 100 микролитрами дистиллированного физиологическим раствором вируса, разведенного в 10 раз в свежей питательной среде, как показано, и контролируйте импеданс клеток каждые 15 минут в течение не менее 100 часов.