Анализ реактивных веществ тиобарбитуровой кислоты для оценки окислительного стресса в сыворотке крови человека

Клетки генерируют низкий уровень свободных радикалов во время метаболических процессов.

При патологических состояниях происходит перепроизводство свободных радикалов, вызывающих окислительный стресс. Эти свободные радикалы атакуют полиненасыщенные жирные кислоты в фосфолипидах клеточных мембран в процессе, называемом перекисным окислением липидов. При этом образуются токсичные продукты окисления, в том числе гидропероксиды липидов и малоновый диальдегид (МДА), которые вызывают повреждение мембран и гибель клеток.

Чтобы обнаружить окислительный стресс в сыворотке крови человека in vitro с помощью анализа реактивных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS), начните с пробирки, содержащей сыворотку человека, обработанную соединением, вызывающим окисление. Обработанная сыворотка в основном содержит продукты перекисного окисления липидов — MDA и гидропероксиды липидов, а также фосфолипиды, липиды и белки.

Затем добавьте додецилсульфат натрия (SDS) и перемешайте для растворения липидов и высвобождения MDA. SDS денатурирует любые загрязняющие белки. Добавьте подходящий кислотный буфер, а затем кислую тиобарбитуровую кислоту (ТБК). Инкубировать при высокой температуре.

В кислых условиях и при высоких температурах молекулы ТБА вступают в реакцию с МДА, образуя стабильный красно-розовый комплекс МДА-ТБА, получивший название ТБА. Инкубируют на льду, чтобы остановить реакцию и стабилизировать имеющиеся комплексы.

центрифуга. Соберите и перенесите содержащую MDA-TBA надосадочную жидкость в многолуночный планшет. С помощью считывателя микропланшетов измерьте впитываемость комплекса.

Более высокая абсорбция предполагает высокую концентрацию TBARS, что указывает на более высокий уровень продуктов перекисного окисления липидов и окислительного стресса в сыворотке.

Пометьте стеклянные пробирки для анализируемых образцов, затем добавьте в каждую пробирку по 100 микролитров подготовленного образца. Добавьте 200 микролитров 8,1% SDS в каждый образец и аккуратно покрутите стеклянную трубку круговыми движениями, чтобы перемешать.

Добавьте 1,5 миллилитра 3,5 молярного буфера ацетата натрия в каждый образец. Затем добавьте 1,5 миллилитра водного 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты. Доведите итоговый объем в каждой пробирке до 4 миллилитров, добавив 700 микролитров деионизированной воды. Плотно закупорьте стеклянные трубки и инкубируйте их в нагревательном блоке, установленном при температуре 95 градусов Цельсия, в течение 1 часа. Накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить образование конденсата. Затем извлеките трубки из колодки и инкубируйте их на льду в течение 30 минут.

После инкубации образцы и стандарты центрифугируются при давлении 1500 x g в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Перенесите 150 микролитров надосадочной жидкости из каждой пробирки в лунку в 96-луночном планшете, удаляя все пузырьки воздуха с помощью наконечника для дозатора.

Измерьте поглощение образцов на 532 нанометрах. Затем вычтите среднее значение поглощения пустых образцов из всех других показаний поглощения.

Создайте стандартную кривую и используйте ее для расчета неизвестных концентраций образцов.