$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
В глазу млекопитающих сосудистая оболочка, расположенная между склерой и сетчаткой, содержит периваскулярные макрофаги и хориокапилляры — слой кровеносных капилляров, выстланный перицитами, который снабжает сетчатку кислородом и питательными веществами. Аномальное прорастание кровеносных сосудов из хориокапилляров встречается при нескольких сосудистых заболеваниях глаз.
Чтобы изучить нарушение регуляции хориокапилляров, прорастающих ex vivo, возьмите собранные экспланты мышиного глаза, содержащие сосудистую оболочку, прикрепленную к склере и пигментному эпителию сетчатки, или РПЭ.
Добавьте капли экстракта базальной мембраны, или BME — гидрогеля, обогащенного белками внеклеточного матрикса, — в лунки многолуночного планшета. Поместите экспланты в каплю, не допуская сплющивания тканей. Дайте BME застыть.
Добавьте среду с добавлением эндотелиальных клеток, или ЕС-специфических факторов роста. Инкубировать. РПЭ секретирует фактор роста эндотелия сосудов, который, наряду с специфичными для ЭК факторами роста, стимулирует пролиферацию капиллярных ЭК
.
Затвердевший БМЭ образует внеклеточный матрикс, который способствует образованию пролиферирующих ЭК с образованием прорастающих капилляроподобных канальцев. Перициты мигрируют и прикрепляются к этим прорастающим капиллярам, способствуя созреванию капиллярных ЭК.
Активированные макрофаги в области прорастания выделяют ферменты для переваривания мембраны Бруха — самого внутреннего слоя хориоидеи, что позволяет росткам мигрировать в РПЭ.
Под микроскопом визуализируйте прорастающие капилляры. С помощью подходящего программного обеспечения измерьте площадь, покрытую ростком сосудистой оболочки.
Большая площадь прорастания хориокапилляров указывает на прогрессирующее прорастание хориокапилляров в эксплантте.
Добавьте 30 микролитров размороженного БМЭ в центр каждой лунки 24-луночного планшета для культуры тканей. Следите за тем, чтобы капля BME образовывала выпуклый купол в нижней части пластины, не касаясь краев.
Поместите салфетку в середину BME. Не расплющивайте сосудистую оболочку экспланта. Дайте ткани расшириться внутри БМЭ. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы гель застыл. Затем добавьте в каждую лунку по 500 микролитров полной классической среды. Меняйте классическую среду через день.
Прорастание сосудистой оболочки глаза можно наблюдать уже через три дня с помощью микроскопа. Откройте изображение прорастания сосудистой оболочки с помощью Изображения J и отметьте галочкой "Изображение | Тип | и 8-битный» с оттенками серого. Затем оптимизируйте контрастность, выбрав «Изображение | Настройка | Яркость/Контрастность» и его регулировка.
С помощью функции «Волшебная палочка» обведите контуром и удалите ткань сосудистой оболочки, которая присутствует в центре ростков. Удалите фон изображения с помощью бесплатных инструментов выделения.
Далее перейдите в раздел "Изображение | Настройка | Порог» и используйте функцию «Порог» для определения микрососудистых ростков на фоне и периферии. Нажмите «F2», и появится сводка. Нажмите «Сохранить», чтобы сохранить изображение выбранной области в той же папке, что и исходное изображение, для дальнейшего использования.
После того, как группа образцов будет измерена, скопируйте записанные данные для анализа.