Резонансный перенос энергии Форстера с временным разрешением для мониторинга фосфорилирования белков в клетках

Фосфорилирование определенных клеточных белков является ключевым регуляторным механизмом, который приводит к их активации или дезактивации.

Чтобы контролировать фосфорилирование специфических белков, возьмите культуральную пластину, содержащую адгезивные клетки. Обработайте клетки стимулятором, чтобы способствовать фосфорилированию белков в клетках. Отсадите отработанную среду и добавьте буфер для лизиса клеток и коктейль ингибиторов фосфатазы.

Компоненты буфера вызывают лизис клеток, высвобождая клеточное содержимое вместе с фосфорилированными и нефосфорилированными белками. Коктейль ингибиторов инактивирует клеточную фосфатазу, благодаря чему фосфорилированные белки остаются неповрежденными.

Перенесите лизат клеток в детектирующую пластину малого объема. Обрабатывайте лизат донорскими и акцепторными антителами, прикрепленными к различным светочувствительным флуорофорам.

Во время инкубации донорские антитела распознают определенный эпитоп на тестируемом белке, что позволяет им связывать фосфорилированные и нефосфорилированные варианты белка. В отличие от этого, акцепторные антитела связываются исключительно с фосфорилированной формой тестируемого белка.

Это связывание приближает а