Люминесцентный анализ для оценки нейротоксичности тестируемых соединений на нейроны

Нейритовые выросты, где нейроны развивают проекции, имеют решающее значение для нейронной функции и регенерации.

Для оценки нейротоксических эффектов нейритных тестовых соединений, способствующих росту нейритов, in vitro получают суспензию нервной клетки-предшественника человека, hNPC, в дифференцировочных средах.

Засейте клетки в лунки с многолуночными планшетами, покрытыми поли-L-лизином и ламинином, облегчающими прикрепление клеток к дну лунки и поддерживающими рост клеток. Составляющие среды дифференцировки способствуют дифференцировке hNPC в нейроны.

Обработайте один комплект лунок тестовым составом, способствующим росту нейритов. Он взаимодействует с нейронами, полученными из hNPC, и может индуцировать рост нейритов, не нарушая клеточных метаболических процессов и последующей концентрации аденозинтрифосфата, АТФ — основного клеточного источника энергии.

Добавьте одноступенчатый реагент, содержащий детергенты, фермент люциферазу и субстрат люциферазы, люциферин и ингибиторы АТФазы вместе с ионами магния, и перемешайте.

Детергенты разрушают клеточную мембрану, что приводит к лизису клеток и внутриклеточному выбросу АТФ в раствор. Ингибиторы АТФазы ингибируют высвобождаемую эндогенную АТФазу, что может препятствовать измерению АТФ. Центрифуга, отстаивание клеточного мусора.

Во время инкубации высвобожденная АТФ с ионами магния заставляет люциферин связываться с люциферазой, что приводит к окислению люциферина до сильно возбужденного оксилюциферина, испуская биолюминесцентный фотон при релаксации до его основного состояния. С помощью считывателя микропланшетов измерьте люминесценцию, указывающую на концентрацию АТФ.

Более высокая концентрация АТФ свидетельствует о более высокой жизнеспособности клеток, что свидетельствует об отсутствии значительной токсичности тестового соединения для нейронов.

Чтобы покрыть планшет, добавьте 30 микролитров поли-L-лизина в каждую лунку 384-луночного планшета и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 1 часа. Дважды промойте его PBS и дайте высохнуть примерно 30 минут.

Добавьте по 30 микролитров ламинина в каждую лунку, затем выдержите пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 часов. Повторите промывки с PBS и приступайте к покрытию ячеек. Добавьте 20 000 одноклеточных нейросфер в 25 микролитрах дифференцировочной среды в каждую лунку 384-луночного планшета и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5 дней.

Навыки высокоточного пипетирования необходимы для нанесения точного количества нейросфер, которые разбиваются на отдельные клетки. Поэтому дифференцировать нейросферы в нейроны, перед нанесением покрытий рекомендуется для достижения более воспроизводимых результатов.

После инкубации добавьте в каждую лунку по 5 микролитров испытуемого соединения в концентрации, в 6 раз превышающей желаемую, и инкубируйте клетки еще 24 часа.

Чтобы провести анализ жизнеспособности клеток, добавьте в каждую лунку по 30 микролитров люминесцентного реактива, и оставьте пластину на шейкере на 2 минуты. Центрифугируйте планшет при 300-400 перегрузках в течение 30 секунд. Затем выдержите тарелку при комнатной температуре в течение 10 минут, защищая ее от света. После инкубации измерьте люминесценцию на микропланшетном риддере.