Почему измерение длины нейритов имеет значение для валидации мишени?

Длина нейритов служит количественным фенотипическим показателем для оценки того, стимулирует или ингибирует целевой белок развитие нейрональных отростков, что дает функциональные доказательства, выходящие за рамки подтверждения экспрессии.

Как разделение экспрессии EGFP и целевого белка способствует достижению целей конвейера по поиску новых лекарственных средств?

Двухцветная флуоресценция позволяет специфически идентифицировать ко-трансфицированные нейроны, гарантируя, что наблюдаемые эффекты в нейритах обусловлены действием целевого белка, а не вариабельностью трансфекции.

Что позволяют количественные измерения нейритов при оценке мишени?

Количественные данные о длине нейритов позволяют проводить статистическое сравнение между различными условиями, что обеспечивает анализ зависимости «доза-эффект» и отбор хитов в ходе скрининговых кампаний.

Почему требования к воспроизводимости важны для кросс-функционального взаимодействия?

Визуализация не менее 40 EGFP-положительных нейронов для каждого условия обеспечивает достаточную статистическую мощность, что позволяет надежно обмениваться данными между группами фундаментальной биологии и доклинических исследований.

Какой статистический анализ необходим перед внедрением данного метода в рабочий процесс скрининга?

Для определения значимых различий в длине нейритов между контрольной группой и группой с экспрессией целевого белка требуются базовые методы сравнительной статистики (например, t-критерий или ANOVA), что позволяет принять решение о продолжении или прекращении исследований.

Иммунофлуоресцентный анализ для оценки влияния целевых белков на рост нейритов

JoVE Encyclopedia of Experiments

Биологические методы

0 просмотров • 3:52 мин • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развивающиеся нейроны расширяют цитоплазматические процессы из своих клеточных тел путем вырастания нейритов для развития дендритов и аксонов, которые необходимы для коммуникации между нейронами.

Для изучения влияния целевого белка на рост нейритов берут многолуночный планшет с покровным стеклом, покрытым поли-D-лизином, в основании. Поверхность покровного стекла имеет адгезную культуру первичных корковых нейронов, полученных из эмбрионального мозга крысы.

Обработайте нейроны смесью, содержащей два типа плазмид — плазмиду EGFP, кодирующую усиленный зеленый флуоресцентный белок, и вторую плазмиду, кодирующую целевой белок в подходящем реагенте для трансфекции.

Реагент для трансфекции облегчает проникновение плазмид в клетки.

После трансфекции обе плазмиды экспрессируются, производя зеленые флуоресцентные белки и белки-мишени. Экспрессия EGFP придает зеленую флуоресценцию котрансфицированным клеткам.

Белки-мишени с нейритно-стимулирующим потенциалом инициируют клеточную сигнализацию, что способствует реорганизации цитоскелета и приводит к развитию нейрональных проекций и их удлинению.

Отсадите отработанную среду, и зафиксируйте клетки с помощью параформальдегида. Контрокрашивайте клетки с помощью красных флуоресцентных антител к белкам-мишеням, которые специфически связывают экспрессированные белки-мишени и придают клеткам дополнительную красную флуоресценцию.

Снимите покровное стекло с культуральной пластины и рассмотрите его под флуоресцентным микроскопом.

Котрансфицированные клетки, демонстрирующие двухцветный сигнал флуоресценции, демонстрируют более длинные нейронные процессы, чем клетки, лишенные красной флуоресценции, что подтверждает стимулирующее действие белка-мишени на рост нейритов.

Через два дня при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа разбавьте EGFP и целевые белковые плазмидные ДНК и реагент для трансфекции в двух отдельных 1,5-миллилитровых пробирках, а затем смешайте их вместе. Трансфицируйте клетки с помощью конструкции EGFP, добавив в лунки трансфекционную смесь.

Через 24 часа вымойте клетки с температурой 37 градусов Цельсия PBS, и зафиксируйте их 4% параформальдегидом в PBS на 10 минут в темноте при комнатной температуре.

В конце инкубации трижды промойте неподвижные ячейки свежим PBS за промывку и добавьте минимальный объем флуоресцентного монтажного материала на одно предметное стекло микроскопа на каждый образец. Затем осторожно перенесите покровные стекла с покрытием на монтажный носитель так, чтобы образцы были обращены к предметным стеклам.

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 15 августа 2026

Иммунофлуоресцентный анализ для оценки влияния целевых белков на рост нейритов

Обзор

Основные компоненты исследования

Область науки

Теоретическая часть

Цель исследования

Используемые методы

Основные результаты

Выводы

Часто задаваемые вопросы

Практическая значимость для промышленности

Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках

Ранние этапы поиска и валидация мишени

Скрининг и разработка анализа

Трансляционные и доклинические исследования

Интеграция конвейера и рабочих процессов

Операционное и корпоративное воздействие

Особенности реализации

Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике

Быстрое Синтез и скрининг Химически активированных факторов транскрипции с GFP основе Репортеры

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в Кишечная палочка

На месте Визуализация роста аксонов и динамики конуса роста в культурах эмбриональных срезов мозга Ex vivo

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

Люминесцентный анализ для оценки нейротоксичности тестируемых соединений на нейроны

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов Экстракорпоральное И В Vivo По изучению нейронных Морфология и миграция

Высокое содержание изображений Пробирной для идентификации ботулинического нейротоксина ингибиторов

Использование ближнего инфракрасного флуоресценции и высокого разрешения сканирования для измерения экспрессии белка в мозге грызунов

Улучшенный зеленый флуоресценции белка основе Анализ для изучения Neurite Outgrowth в первичных нейронов

Нейрит Анализ нарост и нейротоксичность оценка с нейронным предшественником человека клетки-производные нейронов