Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 4:02 мин. • July 8th, 2025
Белок-белковые взаимодействия имеют решающее значение для жизненно важных клеточных функций.
Изучение взаимодействий между трансмембранными белками — мембранными белками, охватывающими липидный бислой клеточной мембраны, начинают с лунок многолуночной пластины, содержащей адгезную культуру клеток млекопитающих.
Далее добавьте раствор, содержащий подходящий трансфекционный агент и пару экспрессирующих плазмид.
Одна из экспрессирующих плазмид кодирует представляющий интерес трансмембранный белок, слитый с маленьким нефункциональным фрагментом фермента люциферазы; другая плазмида кодирует второй представляющий интерес трансмембранный белок, слитый с большим нефункциональным фрагментом фермента люциферазы.
Инкубируйте тарелку. Трансфективный агент способствует клеточному поглощению экспрессии плазмид.
Успешно трансфицированные клетки экспрессируют трансмембранные белки. Взаимодействие между экспрессированными трансмембранными белками приводит к тому, что малые и крупные фрагменты, обращенные к цитоплазме, находятся в непосредственной близости, заставляя их связываться и образовывать активный фермент люциферазу.
Замените фильтрующий материал в лунках на фильтрующий материал, не содержащий сыворотки, чтобы свести к минимуму фоновую люминесценцию. Добавьте раствор фуримазина — проникающего в клетки люциферазного субстрата. Фуримазин проникает в клетки, после чего люцифераза окисляет фуримазин, генерируя высокоинтенсивную люминесценцию.
С помощью считывателя микропланшетов измерьте люминесценцию, которая указывает на сильное взаимодействие между трансмембранными белками.
Соберите адгезивный HEK293T клеточной культуре путем трипсинизации и повторно суспендируйте клетки в специальной питательной среде. Выложите ячейки на чистое дно, белая сторона, 96-луночный планшет. Отрегулируйте общее количество скважин для размещения всех проверенных комбинаций и средств управления, включая реплики. Затем культивируйте клетки в течение ночи в стандартных условиях.
На следующий день трансфектируйте клетки с нужными комбинациями экспрессии плазмид. Разведите плазмиды в бессывороточной среде до 6,25 нанограмм на микролитр для каждой конструкции и добавьте реагент для трансфекции на основе липидов в соответствующем соотношении липидов и ДНК.
Инкубируйте плазмиды в соответствии с инструкцией производителя. Затем добавьте 8 микролитров липидно-ДНК-смеси в предназначенные для этого лунки. Перемешайте содержимое планшета с осторожной поворачивательной пленкой и культивируйте клетки в течение от 20 до 24 часов в стандартных условиях.
На следующий день замените кондиционированную среду в каждой лунке на 100 микролитров среды, не содержащей сыворотки, следя за тем, чтобы клетки не отделились при обмене среды.
Непосредственно перед измерением люминесценции смешайте один объем фуримазина с 19 объемами буфера для разведения. Добавьте в каждую лунку по 25 микролитров рабочего раствора фуримазина, и аккуратно перемешайте пластину вручную, или с помощью орбитального шейкера.
Вставьте пластину в люминесцентный считыватель микропланшетов и уравновесьте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10–15 минут. Выберите лунки для анализа и считайте люминесценцию с временем интегрирования 0,3 секунды. При необходимости продолжайте контролировать люминесценцию в течение двух часов.