JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 4:34 мин • July 8th, 2025
Цифровая капельная ПЦР выявляет индель-мутации — случайную вставку или делецию нуклеотидов в ДНК. Это достигается за счет разделения образца на мельчайшие капли и независимой амплификации ДНК в каждой капле.
Для проведения ddPCR необходимо взять образец ДНК, содержащий дикий тип и мутантные вариации гена-мишени. Загрузите смесь образцов и масло в отдельные отсеки камеры каплегенератора, содержащей микрофлюидный канал.
Образец и масло быстро протекают по узким каналам, эмульгируются в месте соединения и разделяются на несколько капель, каждая из которых содержит несколько молекул ДНК.
Теперь возьмем ПЦР-планшет с буфером, содержащим прямые и обратные праймеры, дНТФ, термостабильную ДНК-полимеразу и два зонда, помеченных разными флуорофорами и молекулами-гасителями. Каждый зонд специфичен для определенного типа аллеля — дикого типа или мутантного.
Перенесите капли на планшет для ПЦР. Поместите пластину в термоамплификатор и запустите реакцию. Во время денатурации нити ДНК отделяются. При температуре отжига праймеры и зонды отжигают до матричной ДНК.
Зонд с зелеными и оранжевыми флуорофорами связывается с последовательностью ДНК дикого типа и мутантной ДНК соответственно. Позже ДНК-полимераза удлиняет праймеры, расщепляя молекулы флуорофора и гасителя от зонда, генерируя флуоресцентный сигнал.
Проанализируйте усиленный продукт. Капли с зеленой флуоресценцией содержат последовательность ДНК дикого типа, в то время как оранжевая флуоресценция указывает на мутацию инделя.
Для начала приготовьте 25 микролитров цифровой капельной смеси образцов ПЦР или дПЦР, добавив суперсмесь ddPCR, прямые и обратные праймеры, зонды HEX или ФАМ, ДНК и воду в пропорциях, описанных в тексте. Затем тщательно перемешайте реакцию вортексом.
С помощью многоканальной пипетки объемом 50 микролитров загрузите 20 микролитров смеси образцов ddPCR в средний ряд картриджа. Затем с помощью многоканальной пипетки объемом 200 микролитров загрузите 70 микролитров масла в нижний ряд, не образуя пузырьков по всему пипетированию.
Поместите прокладку, касаясь только краев, избегая центрального вогнутого участка, а затем надежно поместите пластину в генератор капель и закройте крышку, чтобы начать пробег.
Чтобы перенести иммерсионную смесь из верхнего ряда картриджа в 96-луночный планшет, используйте многоканальную пипетку и набирайте 40 микролитров жидкой пробы в течение 3-5 секунд под углом от 30 до 45 градусов. Затем медленно выдавите смесь в лунку в течение более 3 секунд под углом 45 градусов, позволяя ей опуститься сбоку, а затем перейдите ко второй остановке пипетки, чтобы полностью вытолкнуть жидкость. Используя термосвариватели из фольги, запечатайте пластины на 5 секунд при температуре 180 градусов Цельсия.
Поместите герметичную пластину в амплификатор и установите условия ПЦР для рекомендаций NHEJ Drop-Off, установив начальную денатурацию на уровне 95 градусов Цельсия на 10 минут. Затем установите 40 циклов 94 градуса Цельсия на 30 секунд для денатурации, 55 градусов Цельсия на 1 минуту для отжига и 60 градусов Цельсия на 2 минуты для расширения.
После 40 циклов установите удержание при температуре 98 градусов Цельсия на 10 минут, а окончательное удержание при температуре 4 градуса Цельсия. Используйте скорость нарастания 2 градуса Цельсия в секунду для всех этапов. Температура отжига будет варьироваться в зависимости от используемых щупов или грунтовки. Надежно поместите пластину в считыватель капель с маркировкой A1 в левом верхнем углу.
Откройте программу и настройте пластину, назначив FAM в качестве известного опорного канала и HEX в качестве неизвестного для каждой скважины. Затем измените имя для каждого образца. Запустите эксперимент по чтению капель в качестве прямой количественной оценки, сохранив шаблон.