Градиентная полимеразная цепная реакция для определения оптимальной температуры отжига

Градиентная полимеразная цепная реакция — это метод оптимизации температуры отжига, при которой праймеры — одноцепочечная ДНК, специфичная для последовательностей, — связываются с комплементарными сайтами на матричной ДНК.

Возьмите смесь, содержащую прямые и обратные праймеры, dNTP и термостабильную ДНК-полимеразу в соответствующем буфере. Добавьте матрицу ДНК и перенесите составляющие в ПЦР-планшет.

Поместите пластину в градиентный термоамплификатор со специализированным нагревательным блоком. Это создает линейный градиент температуры отжига в диапазоне от 55 °C до 65 °C с постоянным увеличением температуры по всей пластине.

В ходе реакции пластина нагревается при высокой температуре, денатурируя двухцепочечную ДНК на одноцепочечные и активируя ДНК-полимеразу. Позже температура в каждой лунке снижается в соответствии с запрограммированными значениями, что облегчает отжиг грунтовки.

При температуре отжига ниже оптимальной праймеры неспецифически связываются с денатурированной ДНК, что приводит к неспецифической амплификации во время ПЦР-реакции. При температуре выше оптимальной недостаточное количество праймеров связывается с ДНК.

При оптимальной температуре праймеры специфически связываются с целевой ДНК. Затем температура немного повышается, что позволяет полимеразе удлинять праймеры с помощью dNTP. Эти повторяющиеся циклы денатурации, отжига и удлинения приводят к амплификации ДНК.

Проанализируйте продукт в каждой лунке. В скважинах с неоптимальными температурами отжига наблюдается меньшее или неспецифическое усиление.

Оптимальная температура отжига обеспечивает максимальную специфическую амплификацию ДНК.

Чтобы выполнить градиентную ПЦР, начните с подготовки мастер-микса. Затем удалите 19 микролитров мастер-смеси для нешаблонного управления, или NTC, в 96-луночной пластине. Затем добавьте шаблон к оставшемуся мастер-миксу. Аликвотируйте 20 микролитров образца смешайте в 96-луночный планшет. Выполните ПЦР в соответствии с параметрами цикла, а затем сгенерируйте профили термического расплава, используя параметры, упомянутые в рукописи.