Дуплексная цифровая ПЦР для одновременного количественного определения двойных генетических маркеров

Дуплексная цифровая полимеразная цепная реакция — ddPCR — позволяет одновременно количественно обнаруживать два различных генетических маркера.

Для начала возьмем образец, содержащий две разные целевые последовательности. Добавьте смесь, содержащую термостабильный фермент ДНК-полимеразу, dNTP и специфичные для мишени праймеры. Затем добавьте два разных олигонуклеотидных зонда, специфичных для мишеней, меченных флуоресцентными репортерами, и молекулу гасителя для обнаружения усиленных мишеней.

Раствор эмульгируется с маслом для разделения целевых последовательностей на многочисленные нанокапли. Каждая капля, содержащая мишень, действует как отдельный реакционный сосуд.

Запустите процесс термоциклирования для реакции амплификации внутри отдельных нанокапель.

При высокой температуре денатурации двухцепочечные мишени разделяются на одинарные нити.

Уменьшите температуру, чтобы достичь соответствующей температуры отжига, позволив праймерам и олигонуклеотидным зондам прикрепиться к шаблону.

Близость гасителя подавляет флуоресценцию репортера. При температуре удлинения ДНК-полимераза удлиняет праймеры и расщепляет олигонуклеотидный зонд. Несвязанный репортер излучает флуоресценцию.

Пропустите капли через считыватель капель — систему обнаружения флуоресценции. Обнаружение одиночной или двойной флуоресценции указывает на положительные капли, содержащие мишени, в то время как отсутствие сигнала указывает на отрицательные капли.

Отношение положительных капель к общему числу разделов определяет начальную концентрацию целевых последовательностей.

Чтобы начать эту процедуру, сначала подготовьте концентрацию 100 микромоль на литр для всех праймеров в молекулярной воде и зондов в буфере TE pH 8, как описано в тексте протокола. Затем приготовьте мастер-смесь, смешав соответствующее количество цифровой смеси для ПЦР, прямых и обратных праймеров, флуоресцентного зонда и безнуклеазной воды. Перемешайте пипеткой вверх и вниз не менее 10 раз, соблюдая осторожность, чтобы не ввести пузырьки воздуха в раствор.

Поскольку мастер-смесь для дПЦР более вязкая, чем обычная мастер-смесь для количественной ПЦР, для создания однородного раствора необходимо использовать метод смешивания пипетированием. Это позволяет проводить точное количественное определение dPCR на последующих этапах.

Чтобы сделать смесь для анализа для генерации капель для запуска проб в двух экземплярах, пипетку 36 мкл мастер-смеси в обычный ПЦР-планшет. К каждой из 36-микролитровых мастер-смесей смешайте по 12 микролитров ДНК-матрицы, оставив соответствующие репликаторные лунки пустыми на пластине. Включите положительный контроль, чтобы убедиться, что анализ проводится правильно. Не используйте шаблонные элементы управления или NTC, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения внутри планшета, а также установить флуоресцентный базовый уровень для анализа данных.

Перед настройкой генератора капель смешайте смеси для анализа с помощью многоканальной пипетки, чтобы пипетировать смеси вверх и вниз примерно 15 раз. Следите за тем, чтобы наконечник пипетки оставался в жидкости, чтобы избежать образования лишних пузырьков в смеси.

Затем вставьте первый картридж, содержащий восемь лунок, в белый держатель картриджа и защелкните держатель картриджа. Картридж номер один теперь прочно закреплен на месте и не может быть выбит из держателя при образовании капель.

С помощью многоканальной пипетки аккуратно перенесите 20 микролитров пробирной смеси в среднее положение картриджа с пометкой «Образец», не вводя пузырьков воздуха. Нанесите пипетку в 70 микролитров капли масла на левую сторону картриджа с пометкой 'Oil'Oil'.

Накройте картридж прокладкой, убедившись, что прокладка плоская и равномерно удерживается четырьмя тиками по направлению к краю картриджа. Нажмите кнопку с зеленым светом на каплегенераторе, чтобы открыть дверцу и поместить картридж. Нажмите кнопку еще раз, чтобы закрыть генератор. Как только дверь закроется, зеленая кнопка затемнится, и дверь нельзя будет открыть снова.

Генерация капель начнется немедленно и будет продолжаться примерно 1 минуту.

Пока идет генерация капель, поместите второй картридж во второй белый держатель картриджа и подготовьте его так же, как и для первого картриджа. Когда генерация капель будет завершена, тускло освещенная кнопка станет зеленой.

Откройте дверцу каплегенератора. Снимите белый держатель картриджа, в котором находится картридж, и отложите его в сторону. Поместите второй картридж в генератор капель.

Снимите прокладку с картриджа один и выбросьте. Не отстегивайте белый держатель картриджа, так как это может привести к поломке вновь сгенерированных капель.

С помощью многоканальной пипетки, установленной на 40 микролитров, вставьте наконечники в третий столбик картриджа с размеченными каплями под углом 45 градусов и медленно проведите пипеткой вверх все капли. Перенесите их на окончательный планшет для ПЦР, приложив наконечник пипетки к стенке лунки примерно на полпути вниз и медленно выдавливая каплю.

Таким же образом, когда генерация капель для второго картриджа завершена, удалите прокладку из второго картриджа и перенесите образовавшиеся капли на окончательный планшет для ПЦР. Поместите прокалываемую крышку из фольги поверх пластины и поместите ее на герметик для тарелок. Установите герметик на 180 градусов Цельсия. Нажмите «Play» на запайщике и запечатайте на 10 секунд.

Чтобы начать эту процедуру, поместите запечатанную конечную ПЦР-планшет в термоамплификатор. Используйте термоамплификатор, совместимый с конечным планшетом для ПЦР, и со скоростью нарастания температуры 2 градуса Цельсия в секунду.

Выполните следующую тепловую программу: 10 минут при 95 градусах Цельсия, затем 40 циклов по 30 секунд при 94 градусах Цельсия и 60 секунд при 60 градусах Цельсия, а затем 10-минутное удержание при 98 градусах Цельсия. По окончании цикла перенесите планшет в считыватель капель для автоматического измерения флуоресценции в каждой капле в каждой лунке.

Прежде чем приступать к считыванию капель, убедитесь, что капли находятся при комнатной температуре. Начните с открытия прилагаемого программного обеспечения, чтобы настроить считывание капель. В стандартном меню "Настройка", содержащем схему пустого 96-луночного планшета, дважды щелкните по лунке A1, чтобы открыть меню, содержащее три раздела: "Образец", "Анализ 1" и "Анализ 2".

В разделе образцов введите идентификатор образца в поле с надписью «Имя» и установите флажок справа с пометкой «Применить». Затем нажмите на раскрывающееся меню с надписью «Эксперимент». Выберите «КРАСНЫЙ» для обнаружения редких событий и нажмите «Войти».

Перейдите к разделу, обозначенному как «А1». В разделе «Имя» заполните тест и нажмите «Enter». В поле ниже с надписью «Тип» нажмите на выпадающее меню, выберите «Channel 1 Unknown» и нажмите «Enter».

Перейдите к разделу, обозначенному как «А2». В разделе «Имя» заполните тест и нажмите «Enter». В поле ниже с надписью «Тип» нажмите на выпадающее меню, выберите «Channel 2 Unknown» и нажмите «Enter».

Вся информация, полученная на предыдущих шагах, теперь присутствует в скважине А1.

Назовите все последующие лунки, содержащие капли. Чтобы сэкономить общее время настройки, нажмите «Shift» или «Control», чтобы выбрать несколько скважин одновременно. Когда цифровое изображение номерного знака будет зеркально отражать физическую номерной знак, нажмите «OK» в правом нижнем углу меню. В новом меню, которое появится в верхней части схемы пластины, в разделе "Шаблон" выберите "Сохранить как", а затем присвойте имя и сохраните пластину.

В левой части экрана нажмите «Выполнить» и выберите соответствующий набор красителей во всплывающем окне «Параметры запуска». Сбор данных начнется и будет отображаться в программном обеспечении в режиме реального времени.