Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени для диагностики вирусных инфекций

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени полезна для выявления вирусных инфекций.

Начните с образца, содержащего целевую вирусную РНК. Добавьте специфичные для мишени праймеры, помогающие как в синтезе, так и в амплификации ДНК, вместе с ферментом обратной транскриптазой и dNTP.

Добавьте термостабильную ДНК-полимеразу — фермент для амплификации ДНК в циклах ПЦР — и зеленый SYBR — краситель, который интеркалируется в двухцепочечную ДНК, дцДНК. Поместите реакцию в термоамплификатор. Установите подходящую температуру для связывания праймеров с целевой РНК.

Обратная транскриптаза добавляет dNTP к праймеру, одновременно расщепляя матричную РНК, синтезируя кДНК.

Повышают температуру, инактивируя обратную транскриптазу. Понизьте температуру, позволив праймерам отжечь кДНК для последующей амплификации. Увеличьте температуру, чтобы достичь стадии удлинения, когда ДНК-полимераза удлиняет праймеры, синтезируя дцДНК.

Последовательные циклы приводят к экспоненциальной амплификации дцДНК. SYBR зеленый связывается с ДНК во все большем количестве, вызывая пропорциональное увеличение флуоресцентного излучения. Построение графика сигнала флуоресценции, обнаруженного в циклах.

Положительная кривая амплификации указывает на наличие вирусной РНК в образце.

Постепенно увеличивайте температуру, чтобы достичь температуры плавления, денатурируя дцДНК на отдельные нити. Связанные молекулы красителя высвобождаются, теряя флуоресценцию. Нанесите график зависимости убывающей флуоресценции от температуры.

Пик, соответствующий температуре плавления, специфичной для вируса, подтверждает вирусную инфекцию.

Спланируйте схему расположения ПЦР-планшета с помощью электронной таблицы, учитывая как тестовые, так и контрольные образцы. Подготовьте рабочую станцию ПЦР, продезинфицировав поверхности, а если вы используете УФ-шкаф, включите УФ-свет за 10 минут до начала.

Достаньте реагенты и праймеры из морозильной камеры, чтобы они оттаяли, но всегда держите смесь ферментов на льду. Смешайте реагенты и кратковременно центрифугируйте для сбора жидкости. Готовят мастер-смеси ПЦР на лиссавирус и бета-актин, согласно указаниям в рукописи. Оставьте мастер-миксы на льду до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Смешайте и центрифугируйте подготовленные мастер-смеси и распределите 19 микролитров в соответствующие лунки совместимой с ПЦР-машиной планшетной или пробирочной полоски.

В отдельную комнату или УФ-шкаф аккуратно добавьте 1 микролитр подготовленной РНК. Если вы используете УФ-шкаф, включите УФ-свет за 10 минут до начала. После тестовых образцов добавьте положительный контроль и контроль без шаблона.

При добавлении РНК в мастер-смеси убедитесь, что она добавлена в правильную лунку. Используйте план с табличками, чтобы помочь на этом этапе.

Закройте пластину, убедившись, что крышки плоские поперек тарелки, и поверните ее вниз, чтобы собрать всю жидкость на дне лунок. Убедитесь, что в каждой лунке одинаковый объем жидкости и не видно пузырьков. Затем перенесите образцы в ПЦР-машину.

Откройте программу, выбрав «SYBR Green» с «Диссоциацией». Выберите лунки для анализа, выбрав тип образца «Unknown», а в качестве флуоресцентного красителя — «SYBR». Пометьте лунки на планшете информацией об образце, в том числе о том, проводится ли анализ на лиссавирус или бета-актин.

Нажмите на кнопку "Thermal Profile Setup" и измените условия термоциклирования, как указано в рукописи. Нажмите «Пуск», затем выберите место для сохранения файла и установите флажок, чтобы выключить лампу в конце прогона. Когда появится опция запуска до прогрева лампы, нажмите «Запустить сейчас», но убедитесь, что у лампы есть менее 15 минут для прогрева.