Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 4:08 мин. • July 8th, 2025
Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени полезна для выявления вирусных инфекций.
Начните с образца, содержащего целевую вирусную РНК. Добавьте специфичные для мишени праймеры, помогающие как в синтезе, так и в амплификации ДНК, вместе с ферментом обратной транскриптазой и dNTP.
Добавьте термостабильную ДНК-полимеразу — фермент для амплификации ДНК в циклах ПЦР — и зеленый SYBR — краситель, который интеркалируется в двухцепочечную ДНК, дцДНК. Поместите реакцию в термоамплификатор. Установите подходящую температуру для связывания праймеров с целевой РНК.
Обратная транскриптаза добавляет dNTP к праймеру, одновременно расщепляя матричную РНК, синтезируя кДНК.
Повышают температуру, инактивируя обратную транскриптазу. Понизьте температуру, позволив праймерам отжечь кДНК для последующей амплификации. Увеличьте температуру, чтобы достичь стадии удлинения, когда ДНК-полимераза удлиняет праймеры, синтезируя дцДНК.
Последовательные циклы приводят к экспоненциальной амплификации дцДНК. SYBR зеленый связывается с ДНК во все большем количестве, вызывая пропорциональное увеличение флуоресцентного излучения. Построение графика сигнала флуоресценции, обнаруженного в циклах.
П
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео